Rejestracja aktywności neuronalnej rozwiniętej tkanki hipokampa za pomocą penetrującego układu mikroelektrod

Streszczenie

Źródło: Zhang, M., et al. Propagacja aktywności neuronalnej w rozwiniętym preparacie hipokampa z penetrującym układem mikroelektrod. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje procedurę konfiguracji komory rejestracyjnej z penetrującym układem mikroelektrod (PMEA) do przechwytywania sygnałów neuronowych z rozłożonego hipokampa. Metoda ta pozwala nam badać szybkość i kierunek propagacji aktywności neuronalnej w obrębie rozwiniętego hipokampa in vitro.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiedni przegląd etyczny zwierząt.

1. Rozwiązania dla chirurgii i eksperymentalnego nagrywania

1. Przygotować normalny sztuczny bufor płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) zawierający (mM) NaCl (chlorek sodu) 124, KCl (chlorek potasu) 3,75, KH₂PO₄ (diwodorofosforan potasu) 1,25,_MgSO4 (siarczan magnezu) 2, NaHCO₃ (wodorowęglan sodu) 26, dekstroza 10 i CaCl₂ (chlorek wapnia) 2. Na początku eksperymentu należy użyć tego normalnego aCSF do regeneracji tkanek po sekcji oraz do systemu mycia.
2. Przygotuj sacharozę aCSF, która jest używana podczas rozwarstwiania hipokampa i zawiera (mM): sacharozę 220, KCl 2,95, NaH₂PO₄ (diwodorofosforan sodu) 1,3, MgSO₄ 2, NaHCO₃ 26, dekstrozę 10 i CaCl₂ 2. W celu wywołania aktywności padaczkowej w nienaruszonym preparacie tkanki hipokampa, należy dodać 4-aminopirydynę (4-AP) do normalnego aCSF w stężeniu 100 μM.

2. Umieszczanie rozwiniętego hipokampa na penetrującym układzie mikroelektrod (PMEA) w celu zarejestrowania aktywności neuronalnej

1. Aby przygotować zestaw eksperymentalny, napełnij jedną butelkę zwykłym aCSF, a drugą butelką 4-AP aCSF. W obu butelkach bąbelkować 95% O₂/ 5% CO₂ od samego początku każdego eksperymentu. Użyj złącza trójzaworowego, aby kontrolować, które rozwiązanie zostanie wybrane podczas eksperymentu. Podłącz rurkę próżniową na wylocie komory, aby przepompować roztwór do pojemnika na kurz. Podgrzać rurociąg przed dostarczeniem go do komory rejestracyjnej i utrzymywać roztwór na kontrolowanym poziomie temperatury (35 °C).
2. Gdy wlot i wylot komory zapisu są zamknięte, użyj specjalnie wykonanego szklanego zakraplacza do pipet, aby przenieść i umieścić rozłożony hipokamp w komorze. Pod mikroskopem umieść rozłożony hipokamp za pomocą zwykłego małego pędzla, podczas gdy tkanka unosi się w roztworze. Umieść rozłożony hipokamp stroną z zębodołem skierowanym w dół, obszarem CA3 skierowanym na zewnątrz, a polem CA1 skierowanym w stronę badacza.
3. Ostrożnie odessać roztwór z komory za pomocą pipety próżniowej od krawędzi komory rejestrującej, aby obniżyć poziom roztworu, aż komora zostanie wysuszona, a tkanka zostanie opuszczona na matrycę. Następnie ostrożnie umieść wykonaną na zamówienie kotwicę tkankową (ryc. 1) (nr 7 w określonych materiałach i sprzęcie) na wierzchu tkanki, aby utrzymać rozłożony hipokamp na tablicy. Wlej kilka kropli roztworu do komory nagrywającej, aby ją napełnić, i stopniowo otwieraj wlot i wylot, aby dostosować natężenie przepływu do około dwóch kropli na sekundę w komorze kroplowej dożylnej.
4. Inkubować tkankę w komorze rejestracyjnej z normalnym aCSF przez około 1 minutę, aby wyzdrowieć, a następnie zmienić dopływ roztworu na rozpuszczony aCSF 4-AP i odpowiednio dostosować szybkość przepływu. Inkubuj tkankę w rozpuszczonym 4-AP CSF przez około 5 do 10 minut, a następnie badacz może uruchomić oprogramowanie, aby zarejestrować sygnał, gdy pojawi się spontaniczna aktywność.

Wyniki

Rysunek 1. Konfiguracja eksperymentalna. (A) Na obwody nakłada się plastikową pokrywę ze, aby chronić ją przed możliwym uszkodzeniem przez wodę. Komora rejestracyjna posiada zarówno rurki wlotowe, jak i wylotowe do przenoszenia przepływu roztworu. Wykonana na zamówienie kotwica tkankowa klejona siatką z włókna nylonowego służy do zabezpieczania tkanki podczas eksperymentów. (B) Zdj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
mały pędzel	Lowe'a	tem #: 105657 Model #: 90219	Ten o najmniejszym rozmiarze w normalnym opakowaniu pędzli
Narzędzie pomocy ze szkła polerowanego ogniowo	N/a	N/a	To narzędzie zostało wypolerowane ogniowo i wykonane ze zwykłych szklanych pipet Pasteura.
Szklana igła na zamówienie	N/a	N/a	To narzędzie zostało wypolerowane ogniowo i wykonane ze zwykłych szklanych pipet Pasteura.
Wykonane na zamówienie szklane narzędzie z metalową pętlą z drutu	N/a	N/a	To narzędzie zostało wypolerowane ogniowo i wykonane ze zwykłych szklanych pipet Pasteura z metalową pętlą z drutu o zmienionym kształcie.
Szklany zakraplacz wykonany na zamówienie	N/a	N/a	To narzędzie zostało wykonane ze zwykłych szklanych pipet Pasteura z naciętymi końcówkami i gumową głowicą przymocowaną do odciętego końca.
Kotwica tkankowa wykonana na zamówienie	N/a	N/a	Siatka z włókna nylonowego została przyklejona do izolowanego pierścienia z drutu miedzianego. Kotwica tkankowa była przytrzymywana przez mikromanipulator.
Niestandardowa matryca mikroelektrod	N/a	N/a	Więcej szczegółów na temat tablicy można znaleźć w Kibler, et al, 2011.
Wykonane na zamówienie obwody filtrów i wzmacniaczy dla macierzy	N/a	N/a	Więcej szczegółów na temat tablicy można znaleźć w Kibler, et al, 2011.
Procesor akwizycji danych 3400a	Laboratoria Microstar	N/a	Jest to kompletny system akwizycji danych z przetwornikiem A/C.