Przygotowanie modelu szczura do oceny integralności ścieżki wzrokowej przy użyciu konfiguracji elektrofizjologicznej

Abstract

Źródło: Nguyen, C. T. et al., Jednoczesne rejestrowanie elektroretinografii i wizualnych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów.J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje przygotowanie modelu szczura do badania zdrowia siatkówki i integralności szlaku wzrokowego. Wizualny potencjał wywołany i elektrody referencyjne i aktywne elektroretinografii są podłączone do szczura, a następnie wyrównuje platformę ze szczurem przed misą Ganzfelda, aby uzyskać równomierne oświetlenie siatkówki i zamyka klatkę Faradaya, aby uniknąć zakłóceń zewnętrznych.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Preimplantacja elektrod przewlekłego wzrokowego potencjału wywołanego (VEP)

UWAGA: Jeśli mają być odbierane równoczesne sygnały elektroretinogramu (ERG) i VEP, zwierzęta muszą być chirurgicznie wyposażone w elektrody VEP co najmniej 1 tydzień przed pobraniem sygnału.

1. Wysterylizuj stół chirurgiczny przed eksperymentami, czyszcząc go chlorheksydyną (0,5% w 70% etanolu). Autoklaw cały sprzęt chirurgiczny przed użyciem. Przykryj zwierzę wysterylizowaną obłożeniem chirurgicznym. Upewnij się, że wszyscy eksperymentatorzy noszą maski chirurgiczne, fartuchy i wysterylizowane rękawiczki.
2. Znieczulenie należy wywołać za pomocą 3 - 3,5% izofluranu z_O2 przy natężeniu przepływu 3 l/min. Znieczulenie należy utrzymywać na poziomie 1,5% i 2 l/min przez cały czas trwania zabiegu. Zapewnij wystarczającą głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania łapy.
3. Nałóż 1% karboksymetylocelulozy sodu na rogówkę, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
4. Ogolić obszar o wymiarach 30 mm x 30 mm nad czołem, z tyłu oczu i z przodu do uszu.
5. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej (37°C), aby utrzymać temperaturę ciała i ustabilizować głowę zwierzęcia za pomocą ramy stereotaktycznej.
6. Trzykrotnie zdezynfekuj ogolony obszar 10% jodowidonem. W okolicy oczu należy unikać stosowania środków antyseptycznych na bazie alkoholu, zgodnie ze standardem postępowania określonym przez Stowarzyszenie Techników Chirurgicznych.
7. Wykonaj przyśrodkowo-strzałkowe nacięcie na głowie za pomocą skalpela i z tego wytnij okrąg tkanki skórnej o średnicy ~ 20 mm, aby odsłonić kość czaszki.
8. Usuń leżącą pod spodem okostną, zeskrobując i osuszając gazą, aby odsłonić szwy czaszkowe koronalne i strzałkowe.
9. Za pomocą wiertła dentystycznego dołączonego do wiertła, trepanuj dwa otwory (średnica 0,7 mm, głębokość ~ 1 mm) przez czaszkę na obu półkulach we współrzędnych stereotaktycznych: 7 mm ogonowo do bregmy, 3 mm bocznie do linii środkowej.
10. Wkręć ze stali nierdzewnej (średnica 0,7 mm, długość 3 mm, sterylizowane chlorheksydyną) w dwa wstępnie wykonane otwory na głębokość ~ 1 mm (2 mm odsłoniętej), aby umożliwić mocne zakotwienie. Kontaktuje się to z oponą twardą bez uszkadzania leżącej poniżej tkanki korowej.
11. Przygotuj obszar chirurgiczny do amalgamatu dentystycznego, osuszając kość czaszki gazą i cofając luźną skórę za pomocą dwóch szwów 3 - 0 na godzinie ~ 4 i 8.
12. Rozprowadź amalgamat dentystyczny na odsłoniętej czaszce, aby zabezpieczyć elektrody śrubowe (ze stali nierdzewnej opisane w kroku 1.10) na miejscu. Upewnij się, że ~ 1.5 mm pozostaje odsłoniętych do nagrywania.
13. Usuń szwy zwijające.
14. Wstrzyknąć 0,5% karprofenu podskórnie (5 mg/kg) w celu znieczulenia i sól fizjologiczną (chlorek sodu 0,9%, 1,5 ml) podskórnie w celu uzupełnienia płynów.
15. Pozwól zwierzętom dojść do siebie w oddzielnych klatkach. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
16. Nie należy zwracać zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje po operacji (minimum 5 dni).
17. Kontynuuj podawanie 0,5% karprofenu podskórnie w celu znieczulenia (5 mg/kg) raz dziennie przez 4 dni.
18. Rejestruj ERG i VEP 1 tydzień po operacji.

2. Nagrywanie ERG i VEP

1. Przygotowanie do zbierania danych
   1. Użyj oprogramowania komputerowego, aby jednocześnie wyzwolić bodziec i uzyskać dane zgodnie z ustawieniami zalecanymi poniżej.
      1. Wzmocnij sygnały (ERG: ×1,000, VEP: x10,000) z wzmocnieniem ustawionym wewnętrznie przez izolowany przedwzmacniacz i wzmacniacz, przy obu oczach dopasowanych pod kątem impedancji.
      2. Ustaw częstotliwość próbkowania dla ERG na 4 kHz w oknie nagrywania 650 ms (2,560 punktów), Aby to zrobić, kliknij zakładkę "podstawa czasu" w oprogramowaniu do akwizycji danych (nazwa i wersja oprogramowania patrz Tabela materiałów), wybierz "2,560" dla próbek i "500 ms" dla czasu, który zwróci okno nagrywania 650 ms.
         1. Użyj tej samej metody, aby ustawić częstotliwość próbkowania dla VEP na 10 kHz w epoce 250 ms. Pozwól na 10 ms linii bazowej przed bodźcem zarówno dla zapisów ERG, jak i VEP. Aby to zrobić, kliknij zakładkę "Konfiguracja"; wybierz "Stymulator", aby wyświetlić nowe okno dialogowe; w tym oknie wybierz "puls" z listy rozwijanej dla "Tryb"; i ustaw wartość "opóźnienia" na "10 ms".
      3. Ustaw filtrowanie pasmowo-przepustowe ERG na 0,3 - 1,000 Hz (-3 dB). Odbywa się to poprzez kliknięcie "Bio Amplifier" w oprogramowaniu do akwizycji danych. Następnie ustaw wartość "górnoprzepustowego" na "0.3 Hz", a wartość "dolnoprzepustowego" na "1 kHz".
      4. Stosując wyżej wymienioną metodę w ppkt 2.1.1.3, należy ustawić pasmo przepustowe VEP na 0,1 - 100 Hz (-3 dB) zgodnie z zaleceniami Międzynarodowego Towarzystwa Klinicznej Elektrofizjologii Wzroku (ISCEV) dla nagrań VEP u ludzi.

2. Przygotowanie elektrody

1. Wykonaj na zamówienie elektrody aktywne/nieaktywne ERG i aktywne/nieaktywne VEP, mocując odpowiednio srebrny drut lub zacisk krokodylkowy do przewodu elektrody. Uzyskać komercyjnie elektrodę uziemiającą.
2. W przypadku 4 elektrod wykonanych na zamówienie odetnij męski koniec od przedłużenia przewodu elektrody. Usuń 1 cm zewnętrznej powłoki izolacyjnej z politetrafluoroetylenu za pomocą ostrza skalpela, upewniając się, że drut wewnętrzny nie jest uszkodzony.
3. Wstępnie uformuj nieaktywne elektrody ERG, przecinając srebrny drut o długości 70 mm (grubość 0,3 mm) i tworząc pętlę o średnicy ~ 8 mm, aby otoczyć oko szczura. Przygotuj jednolity okrąg, kształtując pętlę na końcówce pipety o pojemności 1 ml.
4. Wstępnie uformuj nieaktywne elektrody VEP, wycinając srebro o długości 70 mm i tworząc elipsę o średnicy ~ 8 mm długości, którą można zaczepić o siekacze szczurów.
5. Wstępnie uformuj aktywne elektrody ERG, przecinając srebrny drut o długości 30 mm i tworząc małą pętlę, aby delikatnie zetknąć się z rogówką szczura (o średnicy ~ 1-2 mm)
6. Bezpiecznie przymocuj elektrody (2 ERG aktywne, 2 ERG nieaktywne, 1 VEP nieaktywne) do przewodu elektrody, splatając srebro z odsłoniętym drutem wewnętrznym.
7. Zaizoluj nadmiar odsłoniętego metalu taśmą maskującą, aby zmniejszyć artefakty fotowoltaiczne.
8. Na nieaktywnych elektrodach ERG przyklej mały kawałek zapięcia na rzep (~ 5 mm × 20 mm) do taśmy maskującej, aby umożliwić stabilne przymocowanie do paska na szyję gryzonia.
9. Przymocuj zacisk krokodylkowy do wewnętrznego przewodu elektrod, aby elektrody aktywne VEP.
10. Przed nagraniami należy galwanizować odsłonięte powierzchnie srebrnych drutów (tj. nieaktywny pierścień i aktywną końcówkę) chlorkiem za pomocą źródła 9 V DC przez 20 sekund, aby poprawić przewodzenie sygnału.
    1. W tym celu zanurz srebrną końcówkę drutu elektrody ERG (działającą jak anoda ogniwa pierwotnego) w zwykłej soli fizjologicznej, a drugi koniec tego przewodu elektrody podłącz do dodatniego zacisku akumulatora 9 V.
    2. Podłącz kolejny przewód (katodę) do ujemnego bieguna akumulatora i zanurz drugi koniec również w soli fizjologicznej. Odłącz po 20 sekundach i obserwuj, czy srebrna końcówka drutu elektrody ERG ma być równomiernie pokryta na biały kolor.
       UWAGA: Przygotuj nowe elektrody ERG na każdą sesję eksperymentalną (~ do 8 godzin), aby zapewnić drożność powłoki chlorkowej.

3. Przygotowanie zwierząt

1. Przystosuj zwierzęta do ciemności przez noc (≥ 8 godzin) przed nagraniami w szczelnym pomieszczeniu. Zapewnij maksymalną adaptację do ciemności, wyłączając oświetlenie w pomieszczeniu oraz zamykając wszystkie drzwi i żaluzje. Zminimalizuj wyciek światła, umieszczając materiały światłoodporne wokół połączeń drzwi/okien i umieszczając ekrany komputerowe na zewnątrz grubych czarnych zasłon.
2. Przygotowanie zwierząt należy przeprowadzić w ciemnym pomieszczeniu za pomocą przyciemnionej czerwonej diody elektroluminescencyjnej (LED; 17,4 cd.m-2, λ_max = 600 nm), aby utrzymać czułość pręcików.
3. Znieczulić szczura, wstrzykując domięśniowo ketaminę/ksylazynę (60: 5 mg/kg). Potwierdź wystarczającą głębokość znieczulenia przy braku odruchu szczypania łapy.
4. Aby utrzymać sedację, w razie potrzeby podać kolejną dawkę znieczulenia (50% dawki początkowej) po 50 minutach.
5. W celu dodatkowego znieczulenia miejscowego nałóż jedną kroplę 0,5% proksymetakainy na każde oko i mrugnij nadmiarem płynu.
6. W celu rozszerzenia źrenicy nałóż jedną kroplę 0,5% tropikamidu na każde oko, a następnie wysusz nadmiar płynu.

4. Pozycjonowanie elektrod ERG i VEP

1. Umieść zwierzę na platformie ERG przed miską Ganzfelda znajdującą się w klatce Faradaya. Unikaj używania elektrycznej poduszki grzewczej, ponieważ może ona wprowadzić szum elektryczny do nagrań elektrofizjologicznych.
   UWAGA: Platforma jest przymocowana do cyrkulacyjnej podgrzewanej platformy wodnej w celu utrzymania temperatury ciała.
2. Przymocuj zwierzę do platformy za pomocą paska zapięcia na rzep umieszczonego mocno, ale nie ciasno wokół karku.
3. Zaczep nieaktywną elektrodę VEP wokół dolnych siekaczy znieczulonego szczura.
4. Ustaw nieaktywne elektrody ERG, nieinwazyjnie otaczając pierścień twardówki wokół równika oka. Ustabilizuj to, mocując elektrody do paska mocującego na rzep wokół karku. Powtórz dla przeciwległego oka.
5. Zamocuj aktywne elektrody VEP, mocując zaciski krokodylkowe do ze stali nierdzewnej wstępnie wszczepionych w czaszkę.
6. Umieść niewielką kroplę 1% karboksymetylocelulozy sodowej na rogówce przed umieszczeniem aktywnej elektrody ERG, aby poprawić jakość sygnału.
   UWAGA: Płyn wiskozowy pomaga również utrzymać nawilżenie rogówki podczas eksperymentów, aby zminimalizować powstawanie zaćmy typu wysuszonego u gryzoni.
7. Umieść niewielką kroplę 1% karboksymetylocelulozy sodu na dolnych siekaczach, aby poprawić kontakt nieaktywnej elektrody VEP, a tym samym jakość sygnału.
8. Ustaw aktywne elektrody ERG tak, aby delikatnie dotykały centralnej powierzchni rogówki za pomocą mikromanipulatora przymocowanego do specjalnie zbudowanego ramienia stereotaktycznego.
9. Wprowadzić 2 - 5 mm elektrody igłowej z uziemieniem (ze stali nierdzewnej) podskórnie do ogona.
10. W razie potrzeby osusz nadmiar płynu z dolnej powieki przed nagrywaniem, aby poprawić jakość sygnału.
11. Przesuń platformę bliżej misy Ganzfelda, upewniając się, że oczy zwierzęcia zrównują się z otworem miski, aby umożliwić równomierne oświetlenie obu siatkówk (patrz krok 2.4.1).
12. Zamknij klatkę Faradaya, aby zredukować zewnętrzny hałas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klips krokodylkowy	Marka generyczna	Zobacz materiał HM3022	Klips ze stali nierdzewnej 26 mm do łączenia elektrod śrubowych VEP z
Biowzmacniacz	Instrumenty ADInstruments	Zobacz materiał ML 135	Do wzmacniania sygnałów ERG i VEP
Sól sodowa karboksymetylocelulozy 1,0%	Alergik	CAS 0009000-11-7	Lepki płyn poprawiający jakość sygnału aktywnej elektrody ERG
Karprofen 0,5%	Grupa ds. Zdrowia Zwierząt firmy Pfizer	CAS 53716-49-7	Nazwa zastrzeżona: Rimadyl do wstrzykiwań (50 mg / ml). W przypadku analgezji pooperacyjnej rozcieńczony do 0,5% (5 mg/ml) w soli fizjologicznej
Chlorheksadyna 0,5%	Laboratoria Oriona	Numer telefonu 27411, numer 80085	Do dezynfekcji narzędzi chirurgicznych
Kąpiel z wodą obiegową	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Do utrzymania temperatury ciała znieczulonego zwierzęcia podczas operacji i zapisów elektrofizjologicznych
Amalgamat dentystyczny	DeguDent Sp. z o.o	64020024	Do obudowy zespołu elektroda-czaszka w celu zwiększenia jego wytrzymałości
Frez dentystyczny	Storz Instruments, Bausch i Lomb	#E0824A	Miniaturowa głowica wiertarska o średnicy ~0,7 mm do wykonania małego otworu w czaszce nad każdą półkulą w celu wszczepienia VEP
wiertarka	Bosch	Seria Dremel 300	Automatyczna wiertarka do trepanacji
Przewód elektrody	Trawiasty telefaktor	F-E2-30	platynowe do podłączenia elektrod z drutu srebrnego do wzmacniacza
Klatka Faradaya	Zamówienie		Zapewnia światłoodporność, aby utrzymać adaptację do ciemności. Dołącza konfigurację Ganzfeld w celu poprawy stosunku sygnału do szumu
Waciki z gazy	Multigate Medical Products Pty Sp. z o.o	57-100 mld	Do osuszania nacięcia chirurgicznego i odsłoniętej powierzchni czaszki podczas operacji
Sfera integrująca Ganzfelda	Międzynarodowe rozwiązania fotometryczne		Specjalnie zaprojektowany stymulator światła: średnica 36 mm, apertura 13 cm
VELCRO	VELCRO Australia Sp. z o.o	Chusta wielokrotnego użytku marki VELCRO	Zapięcie na rzep do mocowania elektrod i zwierzęcia na platformie rejestrującej
Izofluran 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Nazwa własna: Isoflo (TM) Znieczulenie wziewne. Farmaceutyczny środek znieczulający wziewny zmieszany z gazowym tlenem do chirurgii implantów elektrod VEP
Ketamina	Laboratoria Troy	Kość biodrowa Ketamil	Nazwa zastrzeżona: Ketamil Injection, Marka: Ilium. Farmaceutyczny środek znieczulający do zapisu elektrofizjologicznego
Luksusowe diody LED	Phillips Lighting Co.		Do stymulacji świetlnej dwadzieścia diod LED o mocy 5 W i jedna o mocy 1 W.
Mikromanipulator	Aparatura Harvarda	Zobacz materiał BS4 50-2625	Utrzymuje aktywną elektrodę ERG podczas nagrań
Elektroda igłowa	Trawiasty telefaktor	F-E2-30	Podskórnie wprowadzany do ogona, aby służyć jako elektroda masowa zarówno dla ERG, jak i VEP
Minimum fenylefryna 2,5%	Bausch i Lomb	CAS 61-76-7	Wkrapiany tropicamidem w celu uzyskania maksymalnej dylatacji do zapisu ERG
Jod powidonu 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nazwa własna: Betadine, Środek antyseptyczny do przygotowania ogolonej skóry do zabiegu 10%, 500 ml
System akwizycji danych Powerlab	Instrumenty ADInstruments	Zobacz materiał ML 785	Steruje diodami LED
Proksymetakaina 0,5%	Laboratoria Alcon	CAS 5875-06-9	Do znieczulenia rogówki podczas nagrań ERG
Roztwór soli fizjologicznej	Żel elastyczny		Nieiniekcyjne, do galwanizacji elektrod z drutu srebrnego
Oprogramowanie do pomiaru zakresu	Instrumenty ADInstruments	Wersja 3.7.6	Jednocześnie wyzwala bodziec za pośrednictwem systemu Powerlab i zbiera dane
Srebro (cienki drut okrągły)	A&E Metal	0,3 mm	Służy do wytwarzania aktywnych i nieaktywnych elektrod ERG oraz nieaktywnej elektrody VEP
ze stali nierdzewnej	Mikrozagęszczacze		Średnica trzonu 0,7 mm, długość 3 mm, do wszczepienia przez pierwszorzędową korę wzrokową i służenia jako aktywne elektrody VEP
Ramka stereotaktyczna	Dawid Kopf	Wzór 900	Stereotaktyczny instrument dla małych zwierząt do lokalizowania pierwszorzędowej kory wzrokowej zgodnie ze współrzędnymi atlasu mózgu szczura Paxinos & Watson z 2007
Ostrze chirurgiczne	Swann-Morton Sp. z o.o.	Rozdział 206	Do nacinania obszaru skóry nakładającego się na pierwszorzędową korę wzrokową w celu wszczepienia elektrod VEP
szew	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd		3-0 jedwabny pleciony szew niewchłanialny, do retrakcji skóry podczas operacji implantacji elektrody VEP
Tobramycine maść do oczu 0,3%	Laboratoria Alcon	CAS 32986-56-4	Nazwa własna: Tobrex. Profilaktyczna maść z antybiotykiem aplikowana wokół rany skóry po zabiegu chirurgicznym
Tropikamid 0,5%	Laboratoria Alcon	CAS 1508-75-4	Nazwa własna: 0,5% kropli do oczu Mydriacyl, wkrapiane w celu uzyskania rozszerzenia źrenic do rejestracji ERG
Ksylazyna	Laboratoria Troy	Ksylizon biodrowy Xylazil-100	Farmaceutyczny środek znieczulający do zapisu elektrofizjologicznego
Końcówka do pipet	Eppendorf Sp. z o.o	Numer katalogowy: 0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL, do elektrod na zamówienie
Lethabarb Eutanazja Wstrzyknięcie	Virbac (Australia) Pty Ltd	LETHA450	325 mg/ml pentobarbital sodu do szybkiej eutanazji
Program Microsoft Office Excel	Firmy Microsoft	wersja 2010	oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych do analizy danych