$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ustawianie urządzenia do pipet
UWAGA: Ten zestaw składa się z pięciu podstawowych elementów: szklana pipeta, rurka, strzykawka, mikromanipulator i bufor (Hanka) Tabela 1. W tej konfiguracji można użyć dowolnego buforu, który ma fizjologicznie istotne stężenia soli.
- Wyciągnąć pipetę borokrzemianową tak, aby końcówka otwierająca miała średnicę około 45 μm za pomocą ściągacza do mikropipet i zgodnie ze specyfikacjami w tabeli 2.
UWAGA: Stwierdzono, że 45 μm jest odpowiednim rozmiarem dla średnicy otworu pipety w warunkach eksperymentalnych. Niewielkie różnice w wielkości otworu nie powinny znacząco wpłynąć na wyniki. Ważne jest, aby pamiętać, że większe odchylenia od tej liczby powinny nadal działać w przypadku indukcji żylaków poprzez regulację wysokości strzykawki, która jest połączona z pipetą za pomocą rurki, ale będzie to wymagało ponownej kalibracji wartości ciśnienia.
- Włóż odciągnięty koniec pipety do cienkiej gumowej rurki.
nuta: Ścianka rurki powinna być cienka i sztywna, aby zminimalizować opór płynu, zapewniając, że wysokość strzykawki jest wprost proporcjonalna do ciśnienia płynu przepływającego przez pipetę ze znikomym oporem. Rurka nie powinna być dłuższa niż około 0,6 m, aby jeszcze bardziej zminimalizować opór.
- Podłącz drugi koniec rurki do plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml przez złącze z obracanym zaworem.
nuta: Plastikowa strzykawka musi być trzymana na stałej, mierzalnej wysokości, aby zapewnić dokładny pomiar zakładanego ciśnienia płynącego z pipety. Zastosowano wysokość 190 mm, ponieważ zapewnia to minimalny nacisk, ale niezawodnie wywołuje żylaki w aksonach. Można również zastosować inne wartości wysokości, jeżeli ciśnienie powoduje oderwanie komórek od powierzchni szkiełka nakrywkowego. Zaleca się, aby przez cały czas trwania eksperymentu stosować to samo ustawienie.
- Włóż pipetę do górnej części mikromanipulatora, aby utrzymać pipetę na miejscu. Przykręć metalową, płaską przymocowaną do ramienia mikromanipulatora tak, aby trzymała odciągnięty koniec pipety tuż nad miejscem, w którym przymocowana jest gumowa rurka. Ustawić pipetę pod kątem 45° w stosunku do powierzchni szkiełek nakrywkowych zawierających neurony. UWAGA: Mikromanipulator powinien być skonstruowany w taki sposób, aby pipeta mogła być trzymana bez zaciskania gumowej rurki. Mikromanipulator musi umożliwiać ruch pipety w kierunkach x, y i z, aby dokładnie ustawić ją w zasięgu komórek. Grafika i fotografia aparatu znajdują się poniżej (rysunek 1).
- Włącz filtr fluorescencyjny, otwórz przysłonę i upewnij się, że widać fluorescencyjną plamkę przechodzącą przez obiektyw. Za pomocą mikromanipulatora ustawić pipetę w pozycji, która zrównuje końcówkę z plamką fluorescencyjną i opuścić pipetę do pozycji tuż nad wysokością naczynia do hodowli komórkowej (35 mm x 10 mm). Gdy znajdzie się na swoim miejscu, włącz przechodzące światło i wyłącz fluorescencję.
- Za pomocą pęsety dodaj jedno szkiełko nakrywkowe (z komórkami skierowanymi do góry w kierunku pipety) z płytki do hodowli komórkowej do naczynia do hodowli komórkowej zawierającego około 2 ml buforu Hanka w temperaturze pokojowej.
- Umieścić naczynie hodowlane zawierające szkiełko nakrywkowe na lunecie.
- Za pomocą pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości i obiektywu 20X ustaw ostrość na płaszczyźnie około czterech pełnych obrotów nad komórkami (około 0,4 mm). Za pomocą mikromanipulatora ustaw końcówkę pipety tak, aby była skupiona i znajdowała się pośrodku, po lewej stronie płaszczyzny, jak widać przez okulary.
nuta: Dendryty to projekcje, które powinny znajdować się w tej samej ramce, co ciało komórki, z którego pochodzą. Aby wywołać żylaki aksonów, należy podążać za dłuższymi wypustkami z ciała komórki do aksonów przyśrodkowych i dystalnych.
2. Kalibracja ciśnienia pipety z wykorzystaniem systemu z rozciągliwą membraną
- Ustawić pipetę do zaciągania z dokładnie takimi samymi parametrami, jak opisano powyżej, na systemie zawierającym mikrofabrykowaną membranę silikonową (o średnicy 500 μm i grubości 50 μm) i skupić mikroskop na powierzchni membrany.
nuta: System ten został zaprojektowany do pomiaru małych wartości ciśnienia, a wyjaśnienie systemu zostało opublikowane wcześniej. Ten pomiar należy wykonać tylko raz w przypadku eksperymentów z zaciąganiem się, jeśli używane jest dokładnie to samo ustawienie zaciągania się.
- Ustaw ostrość mikroskopu na układach mikrokropek (o średnicy 4 μm i odległości od siebie 10 μm, mierzone między środkami). Przekręć zawór odcinający i pozwól, aby płyn wypłynął z pipety. Zbadaj ugięcie membrany w odpowiedzi na ciśnienie płynu za pomocą mikroskopu konfokalnego.
- Wykorzystaj model liniowy, aby określić odpowiednie ciśnienie związane z ugięciem membrany.
nuta: Podczas gdy niedawne badanie wykazało, że odchylenie w = -3,143 ± 0,69 μm uzyskano dla wysokości strzykawki 190 mm, wytworzyło to ciśnienie 0,25 ± 0,06 nN/μm2 przy obecnej konfiguracji pipet, które mieści się w zakresie fizjologicznym i patologicznym, chociaż wysokość strzykawki nie jest jedynym wyznacznikiem. Na dokładną wartość ciśnienia w neuronach wpływają również inne czynniki, w tym otwarcie pipety, położenie (odległość i kąt) końcówki pipety względem komórek, a nawet elastyczność rurki.
3. Zaciąganie się w celu wywołania żylaków
- Gdy pipeta znajdzie się na swoim miejscu, ustaw ostrość mikroskopu na płaszczyźnie, która zawiera obszar zainteresowania. Umieść komórki i procesy w lewej połowie pola obrazowania (widzianego przez przechwytywanie na żywo przez kamerę) w obszarze zaciągania się, podczas gdy prawa połowa znajduje się poza obszarem zaciągania się.
nuta: Ze względu na rozległy rozrost aksonów i dendrytów neuronów, jest mało prawdopodobne, aby wszystkie procesy neuronu znajdowały się w tym samym obszarze zaciągania się. Jest to właściwie jedna z zalet tego systemu, która pozwala na zbadanie miejscowego efektu zaciągania się. Istnieją dwa rodzaje zaciągania się, które można wykorzystać do wywołania żylaków: długotrwałe zaciąganie się i zaciąganie się pulsacyjnie.
- Sapiąc
- Długotrwałe zaciąganie się
- Umieścić strzykawkę na wysokości 190 mm nad szkiełkiem nakrywkowym zawierającym wyhodowane neurony. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe obszaru zainteresowania ze zoptymalizowanym czasem ekspozycji, ujawniając wyraźną morfologię neuronów. Przechwyć co najmniej 15 klatek w odstępie 2 s (łącznie 30 s) jako linię bazową. Interwał można dostosować w zależności od eksperymentu. Przy klatce 16 otwórz obracany zawór odcinający strzykawki i pozwól płynowi płynać przez 75 ramek (150 s). Przy ramie 75 wyłącz zawór, aby zatrzymać przepływ płynu. Zatrzymaj przechwytywanie wideo.
UWAGA: Powinno to wywołać żylaki aksonów w neuronach 7-9 DIV w ciągu 5-10 s, podczas gdy starsze neurony potrzebują więcej czasu, aby powstać żylaki.
- Zaciąganie się impulsem (czas trwania 2 s)
- Umieścić strzykawkę na odpowiedniej wysokości (190 mm). Rozpocznij obrazowanie poklatkowe i uchwyć co najmniej 15 klatek (30 s) w odstępie 2 s. Przy klatce 16 otwórz zawór strzykawki i pozwól płynowi spłynąć, a następnie zamknij zawór po 2 sekundach. Odczekaj 5-20 s (w zależności od częstotliwości, która ma być testowana) przed ponownym otwarciem zaworu. Powtórz otwieranie i zamykanie zaworu, aby wytworzyć impulsy płynu i kontynuuj przez łączny okres 150-300 s. Kontynuuj obrazowanie poklatkowe przez 20 minut, aby uchwycić etap rekonwalescencji.
nuta: Gdy odstęp jest dłuższy niż 10 s, impulsy wywołują drastycznie mniej żylaków. W odstępie 20 s impulsy nie mogą wywołać żadnych żylaków. Aby uzyskać wiarygodne, spójne tworzenie żylaków, zaleca się, aby wysokość strzykawki wynosiła około 190 mm. Nie należy podnosić wysokości strzykawki i ciśnienia płynu do punktu, w którym komórki zaczynają odrywać się od powierzchni szkiełka nakrywkowego.
- Przed dniem użytkowania wyczyść zestaw (pipetę, rurkę i strzykawkę), przepuszczając przez zestaw około 10 ml 70% etanolu. Po przepłukaniu etanolem przepuść 10 ml buforu Hanka (lub żądanego buforu) przez zestaw, aby przygotować system do użycia w tym dniu. Po zakończeniu eksperymentów w ciągu dnia wyczyść konfigurację zgodnie z wcześniejszym opisem etanolem, aby zapobiec rozwojowi zanieczyszczeń w nocy.
Tabela 1: Receptura bufora Hanka. Ta receptura przygotowuje bufor wykorzystywany w protokole zaciągania i podczas obrazowania żywych komórek.
powiedział:
powiedział:
| Bufor Hanka (filtr, pH = 7,4, przechowywać w temperaturze 4 °C |
| 150 mM | Zawartość NaCl |
| 4 mM | Kcl |
| 1,2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/ml | D-glukoza |
| 20 mM | HEPESY |
Tabela 2: Parametry ciągnięcia pipet. Podaje parametry, które należy ustawić na ściągaczu do pipet, aby uzyskać otwór o średnicy około 45 μm.
TGL
szt.
TGL
| Parametry ciągnięcia pipet |
| upał | ciągnąć | prędkość | zwłoka | ciśnienie | podjazd |
| Okręg wyborczy 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | Okręg wyborczy 530 |
