$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Stereotaktyczne wstrzykiwanie elektroniki siatkowej do żywego mózgu myszy
UWAGA: Myszy zostały znieczulone przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniną 75 mg/kg ketaminy i 1 mg/kg dekdomitoru. Stopień znieczulenia został zweryfikowany metodą szczypania palców u nóg przed rozpoczęciem operacji. Temperaturę ciała utrzymywano poprzez umieszczenie myszy na kocu homeotermicznym o temperaturze 37 °C w znieczuleniu. Podczas operacji zastosowano odpowiednią technikę sterylną, w tym między innymi autoklawowanie wszystkich metalowych narzędzi chirurgicznych przez 1 godzinę przed użyciem, przy użyciu wysterylizowanych rękawiczek, używanie sterylizatora z gorącymi kulkami przez cały czas trwania operacji, utrzymanie sterylnego pola wokół pola operacyjnego, dezynfekcję narzędzi plastikowych 70% etanolem, a depilowaną skórę głowy preparowano jodoforem przed nacięciem. W przypadku operacji przetrwania, po zakończeniu operacji, wokół rany nałożono maść z antybiotykiem, a mysz zwrócono do klatki wyposażonej w poduszkę grzewczą o temperaturze 37 °C. Myszy nie pozostawiono bez opieki, dopóki nie odzyskały wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Myszom podawano analgezję buprenorfiny we wstrzyknięciu dootrzewnowym w dawce 0,05 mg/kg masy ciała co 12 godzin przez okres do 72 godzin po operacji. Myszy odizolowano od innych zwierząt po operacji. Myszy poddano eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu w dawce 270 mg/kg masy ciała lub perfuzję przezsercową.
- Znieczul mysz i zamocuj ją w stereotaktycznej ramce.
- Nałóż lubrykant do oczu myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Użyj wiertła dentystycznego i ramy stereotaktycznej, aby otworzyć kraniotomię w żądanych współrzędnych czaszki. Otworzyć drugą kraniotomię z dala od miejsca wstrzyknięcia w celu wprowadzenia lub drutu uziemiającego ze stali nierdzewnej.
- Przymocuj podłoże zaciskowe do czaszki za pomocą cementu dentystycznego. Wytnij szczelinę w podłożu o szerokości około 1 mm, aby poprawić niezawodność etapu składania w dalszej części procedury.
nuta: Płaski elastyczny (FFC) przycięty do kształtu litery "L" działa dobrze (ilustracja 4A), chociaż wiele materiałów będzie działać, o ile mają odpowiednią grubość dla 32-kanałowego złącza ZIF (Zero Insertion Force) (przeznaczonego do o grubości 0,18 ± 0,05 mm).
- Zamontuj uchwyt pipety z igłą zawierającą elektronikę siatkową na ramie stereotaktycznej za pomocą końcówki pod kątem prostym clamp (Rysunek 2C i Rysunek 3A).
- Podłącz boczny wylot uchwytu pipety do strzykawki o pojemności 5 ml zamocowanej w pompie strzykawkowej (Rysunek 3D) za pomocą rurki kapilarnej o długości około 0,5–1 m.
nuta: Upewnij się, że w rurki kapilarnej nie ma pęcherzyków powietrza przed podłączeniem jej do uchwytu pipety. Pęcherzyki mogą przerywać przepływ podczas wstrzykiwania i uniemożliwiać płynne, kontrolowane dostarczanie elektroniki siatkowej.
- Użyj ramki stereotaktycznej, aby ustawić końcówkę igły w żądanym miejscu początkowym w mózgu.
nuta: Zastosowane tutaj elektrosondy elektroniczne siatkowe są zaprojektowane z elektrodami rejestrującymi rozmieszczonymi na długości ok. 2 mm, przy czym pierwsza elektroda znajduje się ok. 0,5 mm od krawędzi początkowej elektroniki siatkowej (skrajna lewa krawędź na rysunku 1A). Z tego powodu współrzędne stereotaktyczne powinny być tak dobrane, aby lokalizacja początkowa znajdowała się o 0,5 mm głębiej niż obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Rozmieszczenie i lokalizacja elektrod rejestrujących w elektronice siatkowej może być dowolnie wybierana podczas procesu projektowania maski i powinna być dobrana tak, aby elektrody rejestrujące obejmowały obszar (y) mózgu będący przedmiotem zainteresowania, gdy są wstrzykiwane wzdłuż ich trajektorii stereotaktycznej.
- Ustaw kamerę (Rysunek 3B) tak, aby wyświetlić górną część sondy elektronicznej siatki w szklanej igle. Niektóre programy pozwalają użytkownikowi narysować linię na ekranie, aby zaznaczyć pierwotną pozycję elektroniki siatki.
- Zainicjuj przepływ, ustawiając pompę strzykawkową na niską prędkość i naciskając przycisk Start. 10 ml/h to typowe początkowe natężenie przepływu dla igły kapilarnej o średnicy wewnętrznej 400 μm. Powoli zwiększaj natężenie przepływu, jeśli sonda elektroniczna siatki nie porusza się w obrębie igły.
nuta: Ważne jest, aby zminimalizować objętość płynu wstrzykiwanego do mózgu, ponieważ może to uszkodzić tkankę otaczającą miejsce wstrzyknięcia. Najlepsze wyniki osiąga się przy objętościach wtrysku mniejszych niż 25 μl na 1 mm wstrzykiwanej długości siatki. Idealne wartości to mniej niż połowa tej objętości; W naszym laboratorium zazwyczaj wstrzykujemy 10–50 μl na wstrzykiwaną siatkę o długości 4 mm.
- Gdy sonda elektroniczna siatki zaczyna poruszać się w obrębie igły, użyj ramki stereotaktycznej, aby cofnąć igłę z taką samą szybkością, z jaką wstrzykiwana jest sonda elektroniczna siatki, używając oznaczonej oryginalnej pozycji elektroniki siatki jako przewodnika.
nuta: Ta procedura, zwana metodą wstrzykiwania pola widzenia (FoV), pozwala na precyzyjne dostarczanie elektroniki siatkowej do docelowego obszaru mózgu bez zgniecania lub zwichnięcia. Często natężenie przepływu można zmniejszyć, gdy sonda elektroniczna siatki zacznie poruszać się w igły. W naszym laboratorium natężenie przepływu wynoszące 20–30 ml/h jest często wymagane do pokonania tarcia statycznego między siatką a ściankami igły kapilarnej, ale po rozpoczęciu procesu wstrzykiwania można je zmniejszyć do 10 ml/h. Natężenia przepływu i objętości iniekcji są zwykle mniejsze w przypadku igieł kapilarnych o mniejszej średnicy.
- Kontynuuj przepływ soli fizjologicznej i cofanie igły, aż igła opuści czaszkę. Zatrzymać przepływ z pompy strzykawkowej.
2. Interfejs wejścia/wyjścia
UWAGA: W tym momencie, sonda elektroniczna z pożądanym punktem początkowym w mózgu została wstrzyknięta wzdłuż wybranej trajektorii. Igła została cofnięta i znajduje się tuż nad kraniotomią, a elektronice siatki łączą się od mózgu do igły, a podkładki wejścia/wyjścia (I/O) nadal znajdują się wewnątrz igły (ryc. 4B). W tej sekcji wykorzystano płytkę drukowaną (PCB; Rysunek 4, Rysunek 5) do interfejsu z sondą elektroniczną siatki. Płytka drukowana łączy złącze ZIF z 32-kanałowym standardowym złączem wzmacniacza poprzez podłoże izolacyjne, które staje się stopniem głównym do eksperymentów z nagrywaniem neuronowym. Płytkę drukowaną można dostosować, aby dostosować ją do różnych konfiguracji stopnia głównego. Nasze pliki projektowe są dostępne na żądanie lub na stronie internetowej z zasobami, meshelectronics.org, i mogą być wykorzystane do niedrogiego zakupu płytek PCB od dostawców usług produkcji i montażu PCB.
- Użyj ramy stereotaktycznej, aby ostrożnie poprowadzić igłę do podłoża zaciskowego FFC i w poprzek szczeliny, przepływając roztwór za pomocą pompy strzykawkowej w celu wytworzenia luzu w połączeniach elektroniki siatkowej (rysunek 4C).
- Gdy igła znajdzie się nad podłożem zaciskowym i w poprzek szczeliny, wznowij przepływ z dużą szybkością, aby wysunąć elektromechaniczne podkładki I/O z siatki na podłoże zaciskowe (Rysunek 4D).
- Za pomocą pęsety i pipety z wodą dejonizowaną (DI) zegnij podkładki I/O pod kątem ok. 90° jak najbliżej pierwszej podkładki I/O.
nuta: Gięcie jest konieczne, aby umożliwić włożenie padów do złącza ZIF na płytce drukowanej w kolejnym kroku. Złącze ZIF ma dokładnie taką samą szerokość jak 32 pola I/O sondy elektroniki siatkowej, więc niedoskonałe zagięcie pod kątem 90° lub zagięcie nie występujące tuż przed pierwszym padem I/O spowoduje konieczność odcięcia padów I/O (skrajne lewe pady na rysunku 4E).
- Po wyrównaniu, rozłożeniu i ustawieniu pod kątem 90° do trzpienia siatki, wysusz je na miejscu delikatnie przepływającym sprężonym powietrzem.
nuta: Sondy elektroniczne mesh z mniej niż 32 kanałami mogą być połączone z tą samą 32-kanałową płytą interfejsu. Na przykład nasze laboratorium często używa 16-kanałowych sond elektronicznych z 32-kanałowymi płytkami drukowanymi. Zapewnia to dodatkową przestrzeń w złączu ZIF, ułatwiając interfejs, a dodatkowe kanały bezstykowe są łatwo identyfikowane jako obwody otwarte za pomocą testów impedancji podczas sesji nagraniowych.
- Przyciąć podłoże zaciskowe na prostej krawędzi około 0,5–1 mm od krawędzi podkładek we/wy. Odetnij również obce części podłoża zaciskowego, które utrudnią włożenie do 32-kanałowego złącza ZIF zamontowanego na płytce drukowanej (Rysunek 4F).
- Włóż pady we/wy do złącza ZIF na płytce drukowanej i zamknij zatrzask (Rysunek 4G). Użyj elektroniki pomiarowej, aby zmierzyć impedancję między kanałami a śrubą uziemiającą, aby potwierdzić pomyślne połączenie. Jeśli wartości impedancji są zbyt wysokie, odblokuj złącze ZIF, wyreguluj włożenie i przetestuj ponownie, aż zostanie potwierdzone pomyślne połączenie.
- Zakryj złącze ZIF i odsłonięte połączenia elektroniczne siatki cementem dentystycznym w celu ochrony. Odwróć płytkę drukowaną w szczelinie w podłożu i przymocuj płytkę drukowaną za pomocą cementu do czaszki myszy (rysunek 4H).
nuta: Wygięcie FFC w szczelinie zmniejsza naprężenia mechaniczne, które czasami mogą powodować zerwanie połączeń elektronicznych siatki.
- Pozwól cementowi stwardnieć, zamieniając płytkę drukowaną w solidną, kompaktową stopkę czołową do łączenia podczas kolejnych sesji nagraniowych (ilustracja 4I).
3. Eksperymenty z zapisem neuronowym
- Umieść mysz w ogonie lub innym ograniczniku. Włóż przedwzmacniacz PCB do standardowego złącza wzmacniacza na płytce PCB stopnia głównego. Użyj oddzielnego, aby uziemić odniesienia.
- W przypadku ograniczonych nagrań pozostaw mysz w ograniczniku. Rejestruj dane za pomocą systemu gromadzenia danych dla żądanego okresu (rysunek 5A).
- W przypadku swobodnie poruszających się nagrań, zwolnij mysz z ogranicznika po włożeniu płytki PCB przedwzmacniacza i uziemieniu odniesienia. Nagrywaj przez żądany czas za pomocą systemu akwizycji danych, gdy mysz zachowuje się swobodnie (Rysunek 5B)
