$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Rozwiązania
- Roztwór do krojenia
- Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem roztworu do krojenia.
- Przygotować wcześniej 20-krotny roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
- Aby uzyskać 1x roztwór do krojenia, rozpuść NaHCO3, glukozę i sacharozę w ddH2O i dodaj 20x bulion. Upewnij się, że osmolarność wynosi od 315 do 320 mOsm i przechowuj roztwór nie dłużej niż 1 tydzień w temperaturze 4 °C.
- Napełnij dwie zlewki 100 ml roztworu do krojenia i przykryj je parafilmem. Schłodzić roztwór w zamrażarce do momentu częściowego zamrożenia (około 20 minut w zamrażarce o temperaturze -80 °C). Używając rurki dyspersyjnej gazu, bąbelkować obie zlewki roztworu do krojenia z 95% O2/5% CO2 przez 20 minut na lodzie.
- aCSF (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy), do regeneracji i konserwacji plastrów
- Skład aCSF znajduje się w tabeli 1.
- Przygotować wcześniej 20-krotny roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
- W przypadku 1x aCSF rozpuść NaHCO3 i glukozę w ddH2O i dodaj 20x bulion. Upewnij się, że osmolarność mieści się w zakresie 298-300 mOsm. Roztwór należy zużyć w ciągu 1 dnia.
- aCSF (niski poziom Ca2+ do nagrywania)
- Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem niskiego Ca2+ aCSF.
- Przygotować wcześniej 20-krotny roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
- Aby uzyskać 1x niski Ca2+ aCSF, rozpuść NaHCO3 i glukozę w ddH2O i dodaj 20x (bez CaCl2 i MgCl2) zapasu, CaCl2 i MgCl2 do określonych stężeń. Upewnij się, że osmolarność mieści się w przedziale 298-300. Roztwór należy zużyć w ciągu 1 dnia.
- aCSF (Sr2+ do nagrywania)
- Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem Sr2+ aCSF.
- Przygotować wcześniej 20-krotny roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
- Dla 1x Sr2 + aCSF rozpuść NaHCO3 i glukozę w ddH2O i dodaj 20x (wolne od CaCl2 i MgCl2) zapasy, SrCl2 i MgCl2 do określonych stężeń. Upewnij się, że osmolarność mieści się w przedziale 298-300. Roztwór należy zużyć w ciągu 1 dnia.
- Rozwiązanie wewnętrzne
- Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem roztworu wewnętrznego na bazie K-glukonianu.
- Aby przygotować 20 ml roztworu wewnętrznego, dodaj 15 ml wody klasy biologii molekularnej do probówki o pojemności 50 ml. Następnie wykonuj kolejne kroki na lodzie.
- Przygotuj następujące roztwory z wyprzedzeniem do 1 M stężeń podstawowych w wodzie klasy biologii molekularnej. Dodać (w ml): 2,32 K-glukonianu, 0,24 Na-glukonianu, 0,20 HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy), 0,16 KCl, 0,05 K 2-EGTA (eter potasowo-etylenowy-bis(β-aminoetylowy)-N,N,N′,N′-tetraoctowy), 0,04 MgCl2 do probówki o pojemności 50 ml.
- Dodać 100 μl 0,3 M Na3GTP (sól sodowa 5′-trifosforanu guanozyny)
- Odważyć 44,08 mg K2 ATP (sól dipotasowa adenozyno-5′-trifosforanu) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i dodać 1 ml wody klasy biologii molekularnej, a następnie dodać do probówki o pojemności 50 ml.
- Dostosować pH do 7,2-7,4 za pomocą 1 M KOH. Upewnij się, że osmolarność mieści się w zakresie 283-289 mOsm.
2. Przygotowanie plastra
- Przygotowywanie narzędzi
- Dodać 200 ml aCSF do komory odzysku (zbudowanej ze zlewki o pojemności 250 ml z 4 studzienkami i siatką) i umieścić komorę odzysku w łaźni wodnej (35 °C).
- Przykryj komorę folią parafinową i stale bąbelkuj aCSF 95% O2/5% CO2 za pomocą szklanej rurki dyspersyjnej przez co najmniej 20 minut.
- Ustaw narzędzia do preparowania (skalpel, cienkie nożyczki kątowe, kleszcze, cienki pędzel, plastikowa łyżka).
- Napełnij strzykawkę o pojemności 60 ml około 15 ml lodowatego roztworu do krojenia z kroku 1.1.4.
- Przygotuj platformę preparacyjną, umieszczając bibułę filtracyjną na pokrywie płytki studzienki.
- Przygotuj komorę krojenia, umieszczając ją w tacce na lód i napełniając tackę lodem.
- Ustaw wibratom, zabezpieczając jednorazowe ostrze w uchwycie ostrza.
- Aby zrobić pipetę transferową, złamij końcówkę pipety Pasteura i umieść gumową gruszkę na złamanym końcu.
- Sekcja mózgu myszy
- Znieczulenie zwierzęcia należy umieścić w komorze nasyconej 4% izofluranem, aż do braku odruchów rdzeniowych.
- Odetnij głowę zwierzęcia za pomocą gilotyny i szybko usuń mózg.
- Wykonaj nacięcie linii środkowej za pomocą ostrza skalpela nr 22 od rostralnego do ogonowego.
- Z boku obierz skórę głowy z każdej strony głowy.
- Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć czaszkę z jednej strony od ogona do rostralu (w tym z boku kości czołowych), uważając, aby nie uszkodzić mózgu.
- Użyj kleszczy, aby podnieść fragment czaszki z mózgu i szybko schłodzić mózg 15 ml lodowatego roztworu do krojenia za pomocą strzykawki z kroku 2.1.4.
- Wyjmij mózg z czaszki.
- Umieść mózg w jednej ze zlewek wypełnionych lodowatym roztworem do krojenia (z kroku 1.1.4) z bąbelkami 95% O2/5% CO2.
3. Przygotuj plastry podwzgórza myszy.
- Zablokuj mózg dla pożądanego obszaru mózgu i kąta cięcia (np. W przypadku wycinków koronalnego podwzgórza odetnij tkankę rostralną do skrzyżowania wzrokowego i ogonową do mostu za pomocą ostrza i upewnij się, że blok ogonowy ma płaską powierzchnię prostopadłą do podstawy mózgu).
- Za pomocą wyciętego kawałka bibuły filtracyjnej podnieś mózg od przedniej strony i przyklej tylną stronę do płytki mocującej za pomocą kleju błyskawicznego.
- Szybko umieść płytkę mocującą w komorze krojenia i napełnij ją roztworem do krojenia z drugiej zlewki w kroku 1.1.4.
- Zabezpiecz komorę krojenia i tackę na lód na wibratomie.
- Określ obszar krojenia (przed i z tyłu mózgu) i rozpocznij krojenie plastrów koronalnych o grubości 250 μm. Zalecane parametry: prędkość 0,10 mm/s, amplituda 2 mm.
- Przytnij plastry do odpowiedniego rozmiaru dla pożądanego obszaru mózgu.
- Odzyskaj plastry w temperaturze 35 °C przez 30-45 minut. Następnie wyjmij komorę odzyskiwania z kąpieli rozgrzewającej i pozwól plastrom zregenerować się w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 30 minut. Trzymaj plastry w temperaturze pokojowej przez resztę dnia i kontynuuj ciągłe bąbelkowanie kąpieli 95% O2/5% CO2.
3. Nagrywanie krosowania całej komórki
- Pociągnij pipety z plastrami.
- Korzystając z parametrów sugerowanych w instrukcji obsługi ściągacza do pipet, należy wyciągnąć pipety krosowe z grubościennego szkła do oporu pipet 3-5 MΩ.
- Za pomocą mikrostrzykawki (dostępnej w ofercie lub domowej roboty) napełnij końcówkę pipety przefiltrowanym roztworem wewnętrznym. Aby zrobić mikrostrzykawkę, spal końcówkę strzykawki o pojemności 1 ml i pozwól, aby końcówka opadła, tworząc długą, cienką końcówkę.
- Uzyskaj konfigurację całej komórki.
- Umieść pipetę rejestrującą tuż nad plasterkiem i zrównoważ prąd pipety w trybie cęgów napięcia. Zastosuj lekkie nadciśnienie w pipecie i zablokuj kurek.
- Wybierz zdrową komórkę z nienaruszoną błoną i zbliż się do niej za pomocą pipety. Nadciśnienie powinno spowodować niewielkie zaburzenie w tkance (tj. powolną falę w tkance podczas wchodzenia).
- Powoli zbliżaj pipetę do celi, wykonując ruchy ukośne, aż pipeta utworzy małe wgłębienie na powierzchni komórki.
- Zwolnij blokadę nadciśnienia. Ogniwo zacznie tworzyć uszczelnienie, a rezystancja wzrośnie powyżej 1 GΩ. W cęgach napięciowych trzymaj ogniwo na poziomie -68 mV.
- Lekko odciągnij od ogniwa po przekątnej, aby usunąć nadmierne ciśnienie z ogniwa.
- Kompensacja pojemności pipet szybkich i wolnych.
- Zastosuj krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do uchwytu pipety, aby przebić się przez kuwetę i uzyskać konfigurację całej komórki.
- Przełącz na tryb Cell w oknie testu membranowego w oprogramowaniu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych (np. Clampex).
- Przed każdym zapisem cęgów napięcia należy wykonać test membrany przy użyciu tego samego oprogramowania i zapisać odpowiednie parametry w książce laboratoryjnej (rezystancja membrany, rezystancja dostępu i pojemność).
- Utrzymuj temperaturę kąpieli rejestrującej na poziomie 27–30 °C, a natężenie przepływu na poziomie 1,5–2,0 ml/min do kolejnych eksperymentów.
Tabela 1: Skład różnych rozwiązań.
Rozdział
| Stężenia roztworu (mM) |
| Krojenie | Normalny aCSF | Niska zawartość Ca2+ aCSF | Sr+ aCSF | Pipeta/Wewnętrzna |
| Zawartość NaCl | Rozdział 87 | 126 Rozdział 126 | 126 Rozdział 126 | 126 Rozdział 126 | - |
| Kcl | Rozdział 2.5 | Rozdział 2.5 | Rozdział 2.5 | Rozdział 2.5 | 8 |
| CaCl2 | 0,5 | Rozdział 2.5 | 0,5 | - | - |
| SrCl2 | - | - | - | Rozdział 2.5 | - |
| MgCl2 | 7 | 1,5 | Rozdział 2.5 | 1,5 | cyfra arabska |
| NaH2PO4 | Wydanie orzeczenia 1,25 | Wydanie orzeczenia 1,25 | Wydanie orzeczenia 1,25 | Wydanie orzeczenia 1,25 | - |
| NaHCO3 | 25 | 26 | 26 | 26 | - |
| glukoza | 25 | 10 | 10 | 10 | - |
| sacharoza | 75 | - | - | - | - |
| K-glukonian | - | - | - | - | Rozdział 116 |
| Na-glukonian | - | - | - | - | 12 |
| HEPESY | - | - | - | - | 10 |
| K2-EGTA | - | - | - | - | 1 |
| K2ATP | - | - | - | - | 4 |
| Na3GTP | - | - | - | - | 0,3 |