Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. pHuC_Mermaid Generacja plazmidu
UWAGA: Syrenka to biosensor opracowany przez połączenie domeny wykrywania napięcia (VSD) czujnika napięcia Ciona intestinalis (obecnie Ciona robusta) zawierającego fosfatazę (Ci-VSP) z fluoroforami partnera rezonansu fluorescencyjnego (FRET) Umi-Kinoko Green (mUKG: donor) i monomeryczną wersją emitującego pomarańczowo białka fluorescencyjnego Kusabira Orange (mKOk: akceptor). W przypadku tego biosensora zmiany konformacyjne domeny VSD, wywołane depolaryzacją błony, zwiększają bliskość białek fluorescencyjnych donorowych i akceptorowych, zwiększając w ten sposób transfer energii między nimi (zwiększając współczynnik FRET). VSD zapewnia efektywną lokalizację biosensora na błonie plazmatycznej. Ekspresję neuronalną biosensora (w rdzeniu kręgowym sygnał jest wykrywalny zarówno w interneuronach, jak i neuronach ruchowych) uzyskuje się poprzez sklonowanie otwartej ramki odczytu Syreny (ORF) pod pan-neuronalnym promotorem zebry HuC.
- Amplifikować za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) otwartą ramkę odczytu Syreny (ORF) z plazmidu syreny pCS4+ z polimerazą DNA Pfu (korekta) przy użyciu startera T3 Universal i startera Mermaid SmaI (5′TATCCCGGGATTCGACGGGGTTCAGATTTTA) w celu wprowadzenia miejsca ograniczenia SmaI przed Mermaid ORF.
- Użyć następującej mieszaniny PCR: 0,5 μl polimerazy DNA Pfu, 7,5 μl specyficznego buforu 10x, 1 μl trifosforanów deoksynukleotydowych 10 mM (dNTP), 2,5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), 0,5 μl (50 ng) preparatu plazmidu i 1 μL 20-μM roztworów podstawowych każdego startera w łącznej objętości 50 μL.
- Podgrzewać mieszaninę PCR przez 15 s w temperaturze 95 °C, zalewać ją przez 15 s w temperaturze 50 °C i wydłużać przez 4 minuty w temperaturze 72 °C, co daje łącznie 35 cykli.
- Oczyść żelem specyficzny produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu, zgodnie z protokołem producenta.
- Sklonuj fragment DNA do wektora pCMV-SC zgodnie z protokołem producenta.
- Linearyzuj plazmid syreny dodatni (o nazwie pCMV-SC_Mermaid) enzymem restrykcyjnym SmaI do następnej insercji promotora HuC.
- Ustawić reakcję restrykcyjną w następujący sposób: 0,5 μl (10 U) enzymu restrykcyjnego SmaI, 2 μl zestawu 10x buforu i 5 μg plazmidowego DNA w całkowitej objętości 20 μL. Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę.
- Żelem oczyść strawiony plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.
- Amplifikacja PCR promotora HuC (pHuC), z polimerazą DNA Pfu i genomowym DNA danio pręgowanego jako matrycą, przy użyciu pary starterów specyficznych dla HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5′-GTAGTCGACCAGACTTCAAAAGGGTCCA i HuCprom-rev1: 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) i obejmujący region 3,150 pz przed ATG.
- Przygotuj mieszaninę PCR, stosując następujący schemat: 0,5 μl polimerazy DNA Pfu, 7,5 μl specyficznego buforu 10x, 1 μl 10 mM dNTP, 2,5 μl DMSO, 200 ng genomowego DNA i 1 μl 20-μM roztworów podstawowych każdego startera w całkowitej objętości 50 μL.
- Po początkowym etapie trwającym 2 minuty w temperaturze 95 °C podgrzewać mieszaninę PCR przez 15 s w temperaturze 95 °C, zalewać ją przez 15 s w temperaturze 50 °C i wydłużać przez 4 minuty w temperaturze 72 °C, co daje łącznie 35 cykli.
- Oczyść żelem specyficzny produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.
- Zremisować równomolową ilość oczyszczonego pCMV-SC_Mermaid (etap 1.5) i DNA pHuC (etap 1.7) przy użyciu 1 μl ligazy DNA T4 i 1 μl specyficznego buforu 10X w całkowitej objętości 10 μL. Inkubować reakcję przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
- Przekształć podwielokrotność kompetentnych komórek w 5 μl reakcji ligacji (krok 1.8) zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wybrać klony pHuC-dodatnie (pHuC_Mermaid) z promotorem wprowadzonym we właściwej orientacji przez podwójne trawienie Sal I-EcoRV (miejsce restrykcji SalI zostało wstawione przed fragmentem promotora w kroku 1.6, podczas gdy miejsce restrykcji EcoRV znajduje się poniżej regionu poliadenylacji, PolyA, plazmidu pCMV-SC).
- Ustawić reakcję restrykcyjną w następujący sposób: 0,5 μl (10 U) enzymów restrykcyjnych SalI i EcoRV, 2 μl buforu kit10X i 1 μg pHuC_Mermaid DNA w całkowitej objętości 20 μL. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przeprowadzić reakcje na żelu agarozowym.
2. Mikroiniekcja zarodka
- Przenieść zapłodnione jaja uzyskane z dorosłego danio pręgowanego typu dzikiego (szczep AB) lub Sod1-G93R na szalkę Petriego o średnicy 10 mm za pomocą plastikowej pipety.
- Opłucz zarodki w zimnej (4 °C) wodzie dla ryb i natychmiast wstrzyknij je do żółtka z 200 pg plazmidu pHuC_Mermaid za pomocą mikrowstrzykiwacza (w celu uzyskania ogólnego i szczegółowego opisu procedury mikroiniekcji).
- Za pomocą plastikowej pipety przenieść zarodki na szalkę Petriego i inkubować je w wodzie dla ryb w temperaturze 28 °C, aż osiągną pożądany etap rozwojowy (20-24 godziny po zapłodnieniu, hpf) w celu przeprowadzenia kolejnych analiz.
3. Analiza spontanicznego zwijania ogona
UWAGA: Oceń spontaniczne zwijanie ogona u 20-24 zarodków hpf z lub bez leku riluzol.
- Przenieś zarodek na okrągłą szalkę Petriego o średnicy 90 mm wypełnioną wodą rybną zawierającą 0,2% DMSO (nośnik riluzolu) i ręcznie go zdechorionuj za pomocą dwóch kleszczyków jubilerskich z ostrymi końcówkami. Inkubować zarodek przez 5 minut.
- Wykryj zwijanie ogona w temperaturze pokojowej (RT) podczas 1-minutowego nagrywania wideo za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym. Uzyskuj szeregi czasowe w rozdzielczości czasowej 30 klatek/s.
- Oblicz częstotliwość spontanicznych zwijania ogona, licząc liczbę zgięć (zarówno przeciwbieżnych, jak i ipsilateralnych) na jednostkę czasu.
- Aby ocenić działanie leku riluzol, delikatnie użyj plastikowej pipety Pasteura, aby przenieść zarodek na nową 90-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną wodą rybną zawierającą 5 μM riluzolu.
- Inkubuj zarodek przez 5 minut, a następnie nagraj 1-minutowy film i przeprowadź analizę behawioralną, jak powyżej.
4. Konfiguracja obrazowania do wizualizacji biosensora syreny w żywych zarodkach: jednoczesne wykrywanie sygnałów dawcy i akceptora
- Umieść 20 - 24 zarodki hpf w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w wodzie rybnej o temperaturze 37 °C w naczyniu do obrazowania o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Ułóż zarodki na bokach. Poczekaj, aż agaroza zestali się w temperaturze pokojowej.
- Przenieść czaszę obrazowania do stolika odwróconej konfokalnej zamontowanej na odwróconym mikroskopie. Zidentyfikuj neurony ruchowe wyrażające bioczujnik za pomocą obiektywu 20X (apertura numeryczna 0,7, NA) poprzez wzbudzenie mUKG za pomocą linii lasera argonowego 488 nm i zarejestrowanie jego emisji w zakresie od 495 do 525 nm.
- Aby uzyskać pomiar FRET, wzbudz mUKG, donora pary FRET, za pomocą linii laserowej 488 nm. Jednoczesne wykrywanie, za pomocą skanera rezonansowego pracującego z częstotliwością 8 000 Hz w trybie dwukierunkowym, fluorescencji emitowanej przez donor (między 495 a 525 nm) oraz fluorescencji emitowanej przez akceptor mKOk (między 550 a 650 nm, kanał FRET). Jeśli to możliwe, użyj lasera 473 nm.
nuta: Sprawność wzbudzenia dawcy będzie nieznacznie zmniejszona (85% zamiast 93% przy długości fali 488 nm), ale zmniejszy się również wzbudzenie krzyżowe akceptora (z 17% przy długości fali 488 nm do 9% przy długości fali 473 nm).
- Aby zmniejszyć fototoksyczność i bielenie fluoroforowe, zminimalizuj oświetlenie próbki, zmniejszając moc linii laserowej (w oknie ścieżki wiązki w oprogramowaniu do akwizycji).
- Zoptymalizuj wzbudzenie, aby dopasować parametry wzmocnienia i przesunięcia, które są ustawione na początku eksperymentu i utrzymywane na stałym poziomie przez całą sesję. Aby ustawić przesunięcie, zmień kolor obrazu na wartości intensywności (korzystając z tabeli przeglądowej Q) i podczas skanowania z wyłączonym laserem przekręć pokrętło przesunięcia (inteligentne przesunięcie) tak, aby piksele tła miały intensywność nieco wyższą od zera. Korzystając z tej samej tabeli przeglądowej, włączając laser podczas skanowania, przekręć pokrętło wzmocnienia (inteligentne wzmocnienie), aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, uważając, aby uniknąć nasyconych pikseli.
- Korzystając z otwartego otworka otworkowego (2 jednostki wentylacyjne), uzyskaj 16-bitowe obrazy, aby zapewnić wystarczający zakres dynamiki do analiz ilościowych. Unikaj uśredniania, aby zwiększyć szybkość akwizycji i zminimalizować fotowybielanie.
- W oknie akwizycji oprogramowania wybierz z menu rozwijanego rozmiar pola obrazu 512 x 64 pikseli (rozmiar piksela: 605 nm).
- W oknie trybu akwizycji wybierz xyt (upływ czasu na pojedynczej płaszczyźnie xy) zmenu rozwijanego i rejestruj zmiany napięcia neuronu rdzeniowego zarodka, uzyskując pojedynczą płaszczyznę xy, ustawiając parametry akwizycji tak, aby rejestrować jeden obraz co 30 ms przez 1 min.
- Aby ocenić wpływ podawania riluzolu na depolaryzację błony w tym samym neuronie, należy uzyskać nowy zestaw danych 5 minut po dodaniu wody rybnej zawierającej 5 μM riluzolu.
- Do analizy FRET należy użyć Biosensor_FRET makr ImageJ (wyrażającego jednołańcuchowe biosensory FRET).
- Oceń stosunek FRET błony podstawowej każdego neuronu w t1 jako ((średnia FRET - tło FRET)/(Średnia dawcy - tła dawcy)), gdzie średnia intensywność FRET i dawcy to średnia intensywność fluorescencji obliczona w tym samym obszarze zainteresowania (ROI) narysowanym wokół komórki dla każdego nabytego kanału, a FRET i tło dawcy to średnia intensywność fluorescencji obliczona w ROI pola widzenia bez próbki fluorescencyjnej.
nuta: Szczegółowy opis korzystania z wtyczki krok po kroku znajduje się na stronie www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
- Użyj oprogramowania do tworzenia wykresów, aby porównać częstotliwość, amplitudę i czas trwania depolaryzacji między różnymi paradygmatami eksperymentalnymi. Porównaj dwie grupy za pomocą niesparowanego testu t-Studenta i uznaj średnie wartości za statystycznie różne, gdy P <0,05.
