$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie i znieczulenie zwierząt
- Wywołać znieczulenie u myszy za pomocą inhalacji izofluranu/tlenu. Stosować 4% izofluranu do indukcji znieczulenia i 2-3% do utrzymania przy przepływie tlenu 2,5 l/min. Dostosuj zawartość procentową izofluranu w celu utrzymania znieczulenia w zależności od stanu myszy, tj. małe i słabe myszy wymagają mniej środków znieczulających. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, np. wywierając łagodny nacisk na poduszkę do chodzenia kończyn tylnych, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu odstawienia bólu.
- Kontroluj temperaturę ciała myszy za pomocą termostatycznej płyty grzewczej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec spadkowi temperatury ciała podczas znieczulenia.
- Dopasuj mysz do stożka nosowego w celu podtrzymania znieczulenia. Upewnij się, że zwierzę ma wystarczający dopływ tlenu, sprawdzając, czy nos nie blokuje dróg oddechowych i czy zwierzę oddycha równomiernie.
- Podczas nagrywania monitoruj, czy mysz jest wystarczająco znieczulona, obserwując częstość oddechów (około 1 Hz w znieczuleniu) i brak odruchu wycofania przy łagodnym ciśnieniu. Stężenie izofluranu należy zwiększyć ręcznie, jeśli znieczulenie nie jest wystarczająco głębokie.
- Po pomiarach pozostaw mysz do odzyskania sił na płycie grzewczej lub w cieple lampy na podczerwień, aż odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać leżący mostek, przez około 2-5 minut. Nie zostawiaj myszy bez opieki i w towarzystwie innych myszy, dopóki w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia.
2. Pomiar CMAP w kończynach przednich
- Użyj elektrod igłowych 27 G do pomiarów CMAP kończyn przednich. Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z zalecanymi miejscami umieszczenia elektrod.
- Umieść elektrody na kończynach przednich w następujący sposób.
- Umieść mysz na poduszce grzewczej w pozycji leżącej na plecach i użyj taśmy klejącej, aby wysunąć obie kończyny przednie po bokach ciała (Rysunek 1B).
- Umieść elektrody stymulujące (1 = anoda i 2 = katoda) podskórnie po obu stronach kończyny przedniej, aby wyrównać się z nerwem splotu ramiennego. Unieść skórę, aby wprowadzić igłę prostopadle przez skórę i wepchnąć igłę na około 5 mm pod skórę, nie nakłuwając mięśni znajdujących się pod skórą.
- Umieść elektrodę rejestrującą (3) podskórnie na mięśniu dwugłowym ramienia, unosząc skórę. Umieść elektrodę odniesienia (4) na podkładkach do chodzenia na głębokości 3 mm pod kątem 30 stopni. Umieść elektrodę uziemiającą (5) podskórnie z boku myszy.
nuta: W tej konfiguracji elektrody znajdują się w bliskiej odległości od siebie. Nie dopuszczaj do tego, aby elektrody stykały się ze sobą, ponieważ zniekształca to nagranie.
3. Akwizycja danych
- Rozpocznij stymulację, naciskając przycisk powtarzającego się bodźca w jednostce sterującej i przekręć pokrętło regulatora intensywności, aby zwiększyć bodziec. Stymuluj wszystkie aksony za pomocą 1 impulsu/s o czasie trwania bodźca 0,1 ms. Wybierz odpowiednią częstotliwość i czas trwania z menu rozwijanych w oprogramowaniu.
- Aby osiągnąć bodźce supramaksymalne (5-20 mA; w warunkach demielinizacyjnych do 60 mA), należy stosować bodźce narastające, obracając pokrętło regulatora intensywności, aż amplituda odpowiedzi CMAP przestanie rosnąć. Następnie należy dodatkowo zwiększyć bodziec o 20%, aby upewnić się, że amplituda CMAP osiągnęła maksymalną odpowiedź. Zakończ stymulację, ponownie naciskając przycisk powtarzającego się bodźca.
- Użyj narzędzia markera, aby wskazać następujące punkty w nagraniu: inicjacja bodźca, inicjacja odpowiedzi, maksymalny dodatni szczyt i maksymalny ujemny szczyt (rysunek 2).
- Określ opóźnienie (w ms) jako opóźnienie od zainicjowania bodźca do zainicjowania odpowiedzi (ryc. 2). Zdefiniuj inicjację odpowiedzi jako najwcześniejszy punkt, w którym amplituda zaczyna rosnąć. Użyj opóźnienia, aby ocenić demielinizację w aksonach.
- Zmierz amplitudę (mV) od maksymalnego ujemnego do maksymalnego dodatniego piku (rysunek 2). Użyj wielkości amplitudy, aby skorelować liczbę aksonów funkcjonalnych.
