Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Streszczenie

Źródło: Juusola, M., et al. Elektrofizjologiczna metoda rejestrowania wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film przedstawia protokół elektrofizjologicznego zapisu aktywności fotoreceptorów w oku unieruchomionej Drosophila, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian napięcia w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Protokół

1. Zapis z fotoreceptorów R1-R6

1. Zawsze bądź uziemiony podczas obsługi wzmacniacza mikroelektrodowego (na przykład poprzez dotykanie metalowej powierzchni klatki Faradaya lub stołu antywibracyjnego), ponieważ wyklucza to przypadkowe dostarczenie ładunku statycznego do stopnia głównego, co mogłoby uszkodzić obwody.
2. Oświetl słup platformy do przygotowania much od góry za pomocą dwóch światłowodów na gęsiej szyi (rysunek 1A) (ze źródłem zimnego światła wewnątrz klatki Faradaya), tak aby uchwyt na muchy można było umieścić na tyczce w preferowanej pozycji pod ścisłą kontrolą wzrokową.
3. Zamontuj uchwyt na muchy (z muchą w środku!) na słupie platformy do przygotowania much. Obróć uchwyt na muchy tak, aby lewe oko muchy było skierowane bezpośrednio w stronę badacza (Rysunek 1B).
4. Delikatnie wprowadzić elektrodę referencyjną przez oczka muchy do torebki głowy za pomocą małego gruboziarnistego mikromanipulatora, obserwując preparat przez stereomikroskop (ryc. 1C). Nie wciskaj elektrody zbyt głęboko, ponieważ może to uszkodzić mózg muchy.
   1. Alternatywnie włóż elektrodę odniesienia z tyłu klatki piersiowej. Zawsze upewnij się, że mucha wygląda na zdrową (porusza czułkami), a jej oczy są nienaruszone, nie są przypadkowo uszkodzone. Jeśli preparat wygląda mniej niż nieskazitelnie, przygotuj nową muchę do eksperymentów.
5. Wbij ostrą mikroelektrodę rejestrującą do lewego oka przez mały otwór pokryty wazeliną. Użyj dużego powiększenia w mikroskopie stereoskopowym i przesuń światłowody oraz płaszczyznę ogniskowej tak, aby położenie końcówki elektrody stało się widoczne w 3D dzięki jej wzorcom odbicia.
   UWAGA: Rysunek 1D pokazuje, jak powinna być ustawiona głowa muchy (w stosunku do kąta, pod jakim mikroelektroda rejestrująca wchodzi do oka) dla zapisów fotoreceptorów. Wbicie elektrody do oka bez jej złamania jest najtrudniejszą fazą eksperymentu. Jeśli końcówka elektrody nie trafi w mały otwór w oku, uderzając w rogówkę, zwykle pęka.
6. Włącz wzmacniacz mikroelektrod, gdy obie elektrody znajdą się mocno wewnątrz preparatu, w kontakcie elektrycznym z płynami ustrojowymi muchy.
7. Wyłącz źródło zimnego światła (wewnątrz klatki Faradaya) i odłącz je od sieci. Podłącz jego wtyczkę do centralnego uziemienia, aby zminimalizować szum elektryczny wywołany pętlą uziemienia i odsuń prowadnice świetlne na gęsiej szyi, aby system ramienia Cardan mógł być swobodnie przesuwany wokół muchy. Wyłącz światła w pomieszczeniu, aby upewnić się, że preparat do muchy jest teraz we względnej ciemności.
8. Zmierz rezystancję elektrody rejestrującej w oku. Używaj tylko elektrod rejestrujących, w których rezystancja wynosi 100 - 250 MΩ.
   nuta: Uzyskanie wysokiej jakości zapisów wewnątrzkomórkowych za pomocą elektrody <70 MΩ jest praktycznie niemożliwe. Jeśli rezystancja wynosi <80 MΩ, prawdopodobnie końcówka elektrody jest uszkodzona. W takim przypadku należy wyłączyć wzmacniacz i wymienić elektrodę nagrywającą.
9. Ustaw amplifier w trybie current-clamp (CC) lub bridge recording. Wyeliminuj dowolną różnicę napięcia między elektrodą rejestrującą a elektrodą odniesienia, ponieważ obie spoczywają teraz w elektrycznie połączonej przestrzeni zewnątrzkomórkowej, ustawiając przesunięcie sygnału (napięcie nagrywania) na zero. Śledź zmiany przesunięcia sygnału za pomocą amplifier odczyt wyświetlacza lub ekran oscyloskopu.
10. Odczekaj 2-3 minuty, aż oko muchy przystosuje się do ciemności.
11. Wbij końcówkę elektrody rejestrującej głębiej w oko małymi krokami od 0,1 do 1 mikrona. Zrób to za pomocą piezo-steppera w osi x zdalnie sterowanego mikromanipulatora lub delikatnie obracając pokrętło o małej rozdzielczości manipulatora ręcznego.
12. Stymuluj oko muchy krótkimi (1 - 10 ms) błyskami światła, gdy elektroda rejestrująca jest przesuwana w tkance.
    nuta: Jeśli elektroda rejestrująca jest umieszczona w siatkówce, a oko funkcjonuje normalnie, każdy błysk światła spowoduje krótki i niewielki spadek napięcia (hiperpolaryzacja 0,2 - 5 mV), zwany elektroretinogramem (ERG). Ta zmiana potencjału pola przestrzeni zewnątrzkomórkowej jest spowodowana zbiorową reakcją komórek siatkówki na światło.

Wyniki

Rysunek 1. Ustawienie uchwytu na muchy i elektrod do eksperymentów. Punkty A-B) Uchwyt na muchę jest umieszczony na platformie rejestrującej, która zapewnia również kontrolę temperatury za pomocą elementu Peltiera (A: biała okrągła platforma pośrodku). Ramię Cardana umożliwia dokładne ustawienie bodźca świetlnego w równej odległości (poprzez obrót x,y) wokół muchy, przy czym źródło światła (ciekły l...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stereoskopowy mikroskop zmiennoogniskowy do przygotowania muchy	Olympus	Okulary SZX12 DFPLFL1,6x PF: WHN30x-H/22	Zdolny do ~150-krotnego powiększenia przy dużej odległości roboczej; wykonany na zamówienie ciężki stalowy stojak do montażu na stole
Mikroskop stereoskopowy w układzie wewnątrzkomórkowym	· Olimp	Olympus SZX7; okulary: WHN30x-H/22	Okulary 30X są potrzebne, aby dobrze widzieć odbicia końcówki elektrody podczas wprowadzania jej przez mały otwór rogówki do oka
Mikroskop firmy Nikon	Nikon SMZ645; okulary: C- W30x/7
Stół antywibracyjny	Melles Griot	Z metrycznymi otworami M6 na płytce stykowej	Nasze zestawy na zamówienie mają duży otwór wywiercony w grubej płytce stykowej, który wpuszcza od dołu słup platformy do przygotowania much (mieści miedziany radiator z elektroniką)
Newport
Mikromanipulatory	Narishige powiedział:	Narishige NMN-21	W naszych konfiguracjach wewnątrzkomórkowych stosuje się różne systemy mikromanipulatorów do wprowadzania elektrod rejestrujących shap do oka muchy. Wszystkie wymienione manipulatory z powodzeniem zapewniają długotrwałe, stabilne zapisy z fotoreceptorów Drosophila i LMC.
Huxleya Bertrama	Oś xyz Huxley z precyzyjnym sterowaniem ręcznym
Czujnik	Potrójna oś Sensapex
Märzhäuser	Męrzhäuser DC-3K z dodatkowym krokowym piezoelektrycznym osi x i sterownikiem MS 314
Stojaki magnetyczne	Wystarczy dowolna podstawa magnetyczna z włącznikiem / wyłącznikiem		Na przykład do zarządzania wewnątrz klatki Faradaya
Uchwyty elektrod	Aparatura Harvarda	ESP/W-F10N
Srebrny drut	Światowe instrumenty precyzyjne	AGW1510	Średnica 0,3 - 0,5 mm; musi być chlorowany do uchwytów elektrod
Światłowodowe źródło światła	Wiele różnych, w tym Olympus
Wiązki światłowodowe	Technologia UltraFine		Aby dostarczyć bodziec świetlny LED do systemu ramienia Cardana. Używamy zarówno płynnych, jak i kwarcowych światłowodów (zakres od UV do IR)
Laboratoria Cierniowe
Rurka do katownizacji muchowej		P80-50P 50ml Tuba cent. PP., opakowanie 100 szt.	Odetnij stożkowe dno od plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przyklej do niej końcówkę pipety o pojemności 1 ml.
Cyfrowy system akwizycji	Instrumenty krajowe
Jednoelektrodowy wzmacniacz mikroelektrod o natężeniu prądu/napięcia	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ produkty/wzmacniacze/sec-single- electrode-clamp/sec-10lx.html	Znakomity wykonawca!
Scena czołowa	Standardowy (+/- 150 nA)	Dla npi SEC-10LX
Źródła światła i sterowniki LED	2-kanałowy OptoLED (Cairn Research Ltd., Wielka Brytania)		Wiele z naszych systemów stymulacyjnych jest budowanych wewnętrznie
Samodzielnie zaprojektowany i skonstruowany
Oprogramowanie do akwizycji i analiz	Wiele firm do wyboru		Biosyst; autorski system oparty na Matlabie do prac eksperymentalnych i teoretycznych w laboratorium Juusola
Komputer osobisty lub Mac			Upewnij się, że komputer PC lub Mac jest kompatybilny z systemem akwizycji danych i oprogramowaniem
System ramienia kardana	Samodzielnie zaprojektowany i skonstruowany		Zapewnienie dokładnego pozycjonowania bodźców świetlnych x, y, z
System kontroli temperatury Peltiera	Samodzielnie zaprojektowany i skonstruowany
Klatka Faradaya	Własna konstrukcja		Ekranowanie przed szumami elektromagnetycznymi
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z włóknami		Średnica zewnętrzna: 1 mm
Średnica wewnętrzna: 0,5 - 0,7 mm
Kapilary ze szkła kwarcowego z włóknami		Średnica zewnętrzna: 1 mm
Średnica wewnętrzna: 0,5 - 0,7 mm
Ściągacz do pipet	Firma Sutter Instrument	Model P-2000 laserowy ściągacz do mikropipet płonący / brązowy	W przypadku elektrod referencyjnych borokrzemianowych należy użyć wstępnie ustawionego programu #11 (elektrody krosowe): Ciepło = 350; Żarnik = 4; Prędkość 36; Opóźnienie = 200).1.2.1). W przypadku elektrod rejestrujących borokrzemian należy użyć wstępnie ustawionego programu #12 (zazwyczaj wyciąga on dobre konwencjonalne ostre narzędzia do nagrań fotoreceptorów): Ciepło = 355; Żarnik = 4; Prędkość 50; Opóźnienie = 225; Ciąg = 150. W przypadku nagrań LMC, które wymagają elektrod z drobniejszymi końcówkami, wartości te należy dostosować. Do wyciągania kapilar kwarcowych instrukcja P-2000 sugeruje programy dla mikroelektrody z cienką końcówką. Wstępnie ustawione parametry tych programów służą jako użyteczne punkty wyjścia do systematycznych modyfikacji w celu generowania elektrod o dobrym sukcesie penetracji i niskim poziomie szumów nagrywania.
Zewnątrzkomórkowy roztwór Ringera dla elektrody referencyjnej	Chemikalia od Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacharoza	Zobacz przepis w sekcji protokołu
3 M roztwór KCl do napełniania filamentowej mikroelektrody rejestrującej	Sole od Fisher Scientific	10010310, KCl
wazelina	Vaselin powiedział:

powiedział: