Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Lunsford, E. T., et al. Aktywność neuronów doprowadzających tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie materiałów do zapisów elektrofizjologicznych

1. Zrób naczynie do nagrywania z dnem z elastomeru silikonowego.
   1. Dozuj cienką warstwę samomieszających się składników elastomeru silikonowego (np. Sylgard) do naczynia do hodowli tkankowych ze szklanym dnem, aż zrówna się z krawędzią płytkiej studzienki. Wystarczy około 0,5 ml.
   2. Przykryj i utwardź naczynie przez minimum 48 godzin w temperaturze pokojowej.
2. Zrób szpilki do rozwarstwiania.
   1. Korzystając z zasilacza prądu stałego, doprowadź ładunek ujemny (5 V) do zlewki z wytrawiaczem o pojemności 100 ml (3 M KOH) i podłącz drut wolframowy (0,002 cala; średnica 50,8 μm) do dodatnio naładowanego wyjścia.
      ostrożność: Przewody ujemne i dodatnie nie powinny stykać się ze sobą podczas tej procedury, ponieważ może to spowodować ryzyko powstania iskier, które mogą stanowić potencjalne zagrożenie pożarowe.
   2. Wytraw drut wolframowy, szybko i wielokrotnie zanurzając końcówkę w kąpieli trawiącej, aż końcówka zwęzi się do ostrego końca. Pod mikroskopem stereoskopowym przeciąć drut około 1 mm od końcówki żyletką o prostej krawędzi. Powtórz jeszcze trzy razy, a następnie włóż szpilki do utwardzonej naczynia do nagrywania za pomocą cienkich kleszczyków.
3. Przygotuj elektrody rejestrujące.
   1. Za pomocą poziomego ściągacza do mikropipet z filamentem pudełkowym wciągnij rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego (średnica wewnętrzna: 0,86 mm, średnica zewnętrzna: 1,50 mm) do elektrod z końcówką o średnicy 30 μm z lekkim zwężeniem (ryc. 1 Ai), które będą używane do rejestrowania neuronów aferentnych z tylnej linii bocznej.
   2. Przeciągnij dodatkową rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego do pary elektrod o mniejszych średnicach końcówek (1-5 μm). Trzymając po jednej elektrodzie w każdej ręce, delikatnie przesuwaj końcówki w poprzek siebie, aby rozbić je pod kątem ~30°. Za pomocą mikrokuźni wypoleruj skośną końcówkę, aż będzie gładka.
4. Wygeneruj protokół w programach do rejestracji elektrofizjologii.
   1. Upewnij się, że prawy stopień głowicy jest podłączony do wejścia kanału 1 z tyłu prądu i napięcia mikroelektrody clamp amplifier dla nagrań neuronów doprowadzających.
      UWAGA: Specyfikacja komputerowa wzmacniacza cęgowego prądu i napięcia wymaga minimalnego procesora 1 GHz lub lepszego, systemu Windows XP Pro lub Mac OS X 10.46.6, napędu CD-ROM z 512 MB pamięci RAM, 500 MB miejsca na dysku twardym i 2 portów USB.
   2. Otwórz sterowane komputerowo oprogramowanie wzmacniacza.
   3. Ustaw kanał 1 na tryb cęgów prądowych, klikając przycisk IC.
   4. Wprowadź następujący parametr w zakładce I-Clamp 1. Wyjście pierwotne: 100x potencjał membrany AC (100 000 mV/mV), wzmocnienie: 1 000, Bessel: 1 kHz, AC: 300 Hz, zakres: obejście. Wyjście wtórne: 100x potencjał membranowy AC (100 mV/mV), wzmocnienie: 1, filtr dolnoprzepustowy: 10 Hz.
   5. Zapisz parametr kanału jako Ch1_Aff.
   6. Zainstaluj i otwórz oprogramowanie do elektrofizjologii opaski krosowej.
   7. Kliknij Konfiguruj i wybierz Lab Bench, aby skonfigurować sygnały analogowe, dodając Ch1_Aff do kanałów digitizera (np. Analog IN #0 i Analog IN #1) podłączonych koncentrycznym BNC do odpowiednich wyjść skalowanych kanału 1 amplifier. Kliknij OK.
      UWAGA: Minimalne wymagania komputerowe dla digitizera to: procesor 1 GHz lub lepszy, Windows XP Pro lub Mac OS X 10.46.6, napęd CD-ROM 512 MB RAM, 500 MB miejsca na dysku twardym i 2 porty USB.
   8. Kliknij Pobierz i wybierz Nowy protokół.
   9. Na karcie Mode/Rate (Tryb/Rate) wybierz opcję Gap Free; w obszarze Acquisition Mode (Tryb akwizycji) ustaw Trial Length (Długość próby) na opcję Use available disk space (tj. nagrywaj do momentu zatrzymania) lub żądany set Duration (gg:mm:ss), a następnie ustaw Sampling rate per signal (Hz) na 20 000, aby zmaksymalizować rozdzielczość.
   10. Na karcie Inputs (Wejścia) wybierz kanały Analog IN (Analog In Channels), które zostały wcześniej skonfigurowane (w kroku 1.4.6) i wybierz Ch1_Aff dla odpowiedniego kanału.
   11. Na karcie Wyjścia wybierz Cmd 0 i Cmd 1 odpowiednio dla kanału #0 i kanału #1.
       1. Podłącz polecenie kanału 1 na wzmacniaczu do wyjścia analogowego 0 na digitizerze za pomocą koncentrycznego BNC.
   12. Pozostałe karty mogą pozostać w ustawieniach domyślnych. Kliknij OK i zapisz protokół.

2. Przygotowanie roztworu

1. Przygotuj roztwór Hanka: 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO₄, 0,44 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄, 4,2 mM NaHCO₄; pH 7,3. Rozcieńczyć do 10% roztworu Hanka, dodając do wywaru odpowiednią objętość wody dejonizowanej.
2. Przygotuj roztwór zewnątrzkomórkowy: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl₂, 2,1 mM CaCl₂, 10 mM glukozy i 10 mM bufor HEPES, pH 7,8 dostosowane za pomocą NaOH. Przefiltruj próżniowo roztwór zewnątrzkomórkowy przez filtr o wielkości porów 0,22 μm.
3. Przygotuj α -bungarotoksynę: Rozpuść 1 mg liofilizowanej α-bungarotoksyny w 10 ml roztworu zewnątrzkomórkowego, aby uzyskać 0,1% rozcieńczenia.
4. Przygotuj roztwór do eutanazji: 50% (mg / L) buforowany MS-222 klasy farmaceutycznej w 10% roztworze Hanka.
   UWAGA: α-bungarotoksyna jest silną neurotoksyną, która paraliżuje mięśnie poprzez blokowanie receptorów cholinergicznych. Wymagane są rękawice i zalecana jest ochrona oczu podczas obchodzenia się z paralitykiem.

3. Przygotowanie larw do zapisów elektrofizjologicznych

1. Unieruchomić larwy danio pręgowanego.
   1. Użyć larw z wyhodowanej laboratoryjnie populacji danio pręgowanego (Danio rerio; 4-7 dni po zapłodnieniu) i przechowywać w roztworze zarodkowym (10% roztwór Hanka) w temperaturze 27 °C.
   2. Za pomocą pipety transferowej z dużą końcówką przenieś larwę z obudowy na małą szalkę Petriego (35 mm) i usuń jak najwięcej otaczającego roztworu.
      nuta: Usunięcie roztworu zarodkowego zapobiega rozcieńczeniu paralityka i zwiększa jego skuteczność. Róg chusteczki zadaniowej może być użyty do usunięcia pozostałego roztworu zarodków i bardzo ważne jest, aby nie kontaktować się z larwami ani nie pozostawiać ich wystawionych na działanie powietrza.
   3. Zanurzyć larwy w 10 μl 0,1% α-bungarotoksyny na około 5 minut.
      nuta: Czas potrzebny do unieruchomienia larw różni się w zależności od preparatu. Zdrowy preparat zależy od ścisłego monitorowania utrzymującego się szybkiego przepływu krwi i obniżonych reakcji motorycznych. Krótkotrwała nadmierna ekspozycja na działanie paralityka może prowadzić do powolnego pogorszenia ogólnego stanu zdrowia preparatu, nawet po dokładnym wypłukaniu. Najlepiej jest zastosować płukanie, zanim larwa zostanie całkowicie unieruchomiona, gdy nadal wykazuje oznaki subtelnych wibracji mięśni.
   4. Sparaliżowaną larwę przemyć roztworem zewnątrzkomórkowym i kąpać się przez 10 min.
      nuta: Wymywanie pozwala larwie przejść od subtelnych wibracji mięśni do całkowitego paraliżu. Ponadto α-bungarotoksyna jest antagonistą podjednostki α9 nikotynowego receptora acetylocholiny (nAChR), która jest krytycznym składnikiem endogennego obwodu sprzężenia zwrotnego, który obserwuje ten protokół; Wykazano jednak, że efekt ten jest odwracalny w komórkach rzęsatych Xenopus i danio pręgowanego po 10-minutowym wypłukaniu.
2. Przypnij rybę do naczynia do nagrywania.
   nuta: Znieczulenie (np. MS-222, Tricaine) nie jest wymagane podczas przygotowywania larw danio pręgowanego (4-7 dpf), ponieważ koliduje to ze zdrowiem zwierząt. W rzeczywistości larwy danio pręgowanego są zwolnione z niektórych protokołów dotyczących kręgowców.
   1. Za pomocą pipety transferowej przenieś larwę z kąpieli z roztworem zewnątrzkomórkowym do naczynia rejestrującego z silikonowym dnem. Napełnij pozostałą część naczynia roztworem zewnątrzkomórkowym.
   2. Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie umieść larwy za pomocą kleszczyków z cienką końcówką powyżej środka maty silikonowej, boczną stroną do góry, z przednim i tylnym końcem ciała biegnącym odpowiednio od lewej do prawej. Następnie chwyć wytrawioną szpilkę z maty silikonowej za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i włóż szpilkę, prostopadle do silikonu, przez grzbietową strunę grzbietową larw bezpośrednio grzbietowo do odbytu. Włóż drugą szpilkę przez strunę grzbietową w pobliżu końca ogona, a trzecią szpilkę włóż przez grzbiet struny grzbietowej pęcherza gazowego (Rysunek 1B).
      nuta: Podczas wkładania szpilek ważne jest, aby celować w środek szerokości struny grzbietowej, aby zapobiec uderzeniu w przepływ krwi lub uszkodzeniu otaczających mięśni. Struna grzbietowa jest grzbietowa w stosunku do tylnego nerwu linii bocznej, więc przy prawidłowym przypinaniu nie oczekuje się uszkodzenia neuronów czuciowych linii bocznej. Włożyć po pierwszym kontakcie, aby nie naruszyć otaczającej tkanki. Idealnie, średnica szpilki jest mniejsza niż połowa szerokości struny grzbietowej, aby zapewnić czyste wprowadzenie. Jeśli kołki przekraczają tę szerokość, powtarzaj krok 1.2, aż zostanie osiągnięta żądana szerokość kołka. Jeśli przepływ krwi zwalnia po przypinaniu, powtórz od kroku 1.3 z nową próbką.
   3. Włóż czwartą szpilkę przez pęcherzyk uszny, zapewniając lekki obrót w kierunku przedniego, gdy szpilka wkłada się do kapsułki (ryc. 1B). Po lekkim odwróceniu należy zwrócić uwagę, czy tkanka między cleithrum a pęcherzykiem usznym ujawnia skupisko somatów doprowadzających.
      nuta: Ukośne włożenie czwartego kołka ma na celu zapewnienie odsłonięcia tylnego bocznego zwoju doprowadzającego, który w przeciwnym razie jest zasłonięty przez duży pęcherzyk uszny.

4. Zapis neuronu aferentnego

1. Napełnij aferentną elektrodę rejestrującą 30 μl roztworu zewnątrzkomórkowego, włóż ją do prawego uchwytu na pipety stopnia głowicy (rysunek 1B, C) i opuść do roztworu naczynia, stosując nadciśnienie (1-2 mm Hg) wytwarzane przez przetwornik pneumatyczny.
2. Zlokalizuj i luźno przymocuj do tylnego zwoju doprowadzającego do linii bocznej.
   1. Za pomocą mikromanipulatora opuść końcówkę elektrody doprowadzającej, aż utrzyma się nad cleithrum.
   2. Zwiększ powiększenie do 40-krotnego zanurzenia i zlokalizuj przecięcie nerwu tylnej linii bocznej i cleithrum. Podążaj za nerwem linii bocznej przed cleithrum do miejsca, w którym włókna unerwiają tylny boczny zwój doprowadzający, który można odróżnić po dyskretnym skupisku somy (ryc. 1F).
   3. Umieść końcówkę elektrody nad zwojem doprowadzającym i opuść pipetę, aż końcówka zetknie się z nabłonkiem. Delikatnie manewruj elektrodą tak, aby cały obwód końcówki stykał się ze zwojem doprowadzającym.
   4. Zastosuj podciśnienie (20-50 mm Hg) za pomocą przetwornika pneumatycznego i przytrzymaj.
      nuta: Podciśnienie wywierane na zwój doprowadzający jest łagodne. Zwiększenie podciśnienia może poprawić stosunek sygnału do szumu, ale zdrowie neuronów aferentnych pogarsza się pod wpływem długotrwałego agresywnego ssania, co zmniejsza prawdopodobieństwo udanego nagrania.
3. Rejestruj aktywność neuronów aferentnych.
   1. Lewy stopień główny powinien być podłączony do wzmacniacza, który przekazuje wzmocniony sygnał do digitizera, który wyprowadza wspomniany sygnał do oprogramowania do elektrofizjologii patch clamp, które ma być monitorowane na sąsiednim komputerze.
   2. W pClamp10 kliknij przycisk Odtwórz na pasku narzędzi, aby monitorować neurony aferentne.
   3. Upewnij się, że zapis całej komórki, luźnej łaty neuronów aferentnych jest osiągany, gdy skoki pojawiają się spontanicznie, mniej więcej co 100-200 ms (ryc. 1E).
   4. Stopniowo zwiększaj ciśnienie elektrody rejestrującej neuron aferentny z powrotem do atmosfery (0 mm Hg) i przytrzymaj do końca zapisu.

Wyniki

Ryc. 1: Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny aktywności neuronu doprowadzającego tylnej linii bocznej i brzusznego korzenia ruchowego. (A). Przykład elektrod rejestrujących z luźną plamą aferentną (i) i brzusznym korzeniem ruchowym (ii). Podziałka skali reprezentuje 50 μm. (B) Larwy danio pręgowanego są sparaliżowane i przypięte w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zlewka 100 ml	Pyrex	1000	Resceptacle do wytrawiania
10x obiektyw do zanurzenia w wodzie	Olympus	UMPLFLN10xW	Małe powiększenie do pozycjonowania larw i elektrody rejestrującej
40-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzie	Olympus	LUMPLFLN40XW	Większe powiększenie dla końcówki elektrody pozycjonującej i ustanawiania zacisku krosowego
koncentryczne BNC	ThorLabs powiedział:	2249-C-12	Podłączanie kanałów wzmacniacza i digitizera; wymagane 4
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem	Instrumenty Warnera	G150F-3	Średnica wewnętrzna: 0,86, średnica zewnętrzna: 1,50; szkło kapilarne służące do formowania elektrod rejestrujących
komputer	N/a	N/a	Każdy komputer powinien działać
Zasilanie prądem stałym	Tenma (Tenma)	Nr kat. 72-420	Służy do elektrycznego wytrawiania kołków preparacyjnych
Digitizer elektrofizjologii	Instrumenty aksonowe, urządzenia molekularne	Axon DigiData 1440A	Umożliwia pozyskiwanie danych typu patch-clamp
żarnik	Firma Sutter Instrument	Zobacz materiał FB255B	Filament pudełkowy 2,5 mm stosowany w ściągaczu do mikropipet
Cienkie kleszcze	Narzędzia naukowe	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Nr artykułu 11295-10	Służy do manipulowania larwami i wkładania szpilek
Mikroskop DIC ze stopniem stałym	Olympus	BX51WI	Mikroskop używany do wizualizacji i ustalania zapisów typu patch-clamp
Elastyczna, zwężająca się końcówka do pipet	Fisher Naukowy	02-707-169	Elastyczne końcówki umożliwiają wprowadzenie do elektrody rejestrującej w celu dozowania roztworu zewnątrzkomórkowego na końcówce
Naczynie FluoroDish	Światowe instrumenty precyzyjne Inc.	FD3510-100	Naczynie do nagrywania naczyń ze szklanym dnem
KimWipe (Czyszczenie Systemu)	KimTech (Technologia KimTech)	Numer katalogowy: 34155	Chusteczka zadaniowa służąca do odprowadzania nadmiaru płynu z larw
Kwik-Gard	Światowe instrumenty precyzyjne Inc.	710172	Samomieszający się elastomer sylgardowy
Wzmacniacz mikroelektrod	Instrumenty aksonowe, urządzenia molekularne	Zacisk MultiClamp 700B	Wzmacniacz z zaciskiem krosowym do nagrań dwukanałowych
Mikrokuźnia	Narishige powiedział:	Mikrokuźnia MF-830	Do polerowania elektrody nagrywającej
Jednostka sterująca mikromanipulatora	Siskiyou powiedział:	MC1000-eR/T	4-osiowy koordynator wybierania do sterowania mikromanipulatorem
Ściągacz do mikropipet	Firma Sutter Instrument	Płonący/Brązowy P-97	Do wciągania szkła kapilarnego do elektrod rejestrujących
Jednostka sterująca mikroskopu	Siskiyou powiedział:	MC1000e	Ustawia mikroskop wokół ustalonego stolika i przygotowania
Mikromanipulator z napędem silnikowym	Siskiyou powiedział:	MX7600 (wersja	Ustawia scenę główną i dołączoną elektrodę nagrywającą do nagrywania z zaciskiem krosowym
Sterownik MultiClamp	Urządzenia molekularne	2.2.2	Do pobrania ze strony pobierania Axon MultiClamp 700B Commander
Optyczny stół powietrzny	Korporacja z Newport	VH3036W-OPT	Stół izolacyjny na płytce stykowej do pływania mikroskopu i minimalizacji wibracji podczas nagrań
Zacisk pCLAMP	Urządzenia molekularne	Wersja 10.7.0	Do pobrania ze strony pobierania oprogramowania do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych Axon pCLAMP 10
Szalka Petriego	sokół	Nr kat. 35-3001	Służy do zanurzania larw w paralitach
Uchwyt na pipety	Urządzenia molekularne	1-HL-U	Przytrzymaj elektrodę nagrywającą i podłącz do sceny czołowej
Przetwornik pneumatyczny	Instrumenty biomedyczne firmy Fluke	DPM1B (Biblioteka DPM1B	Do kontrolowania ciśnienia wewnętrznego elektrody rejestrującej
Wodorotlenek potasu	Sigma-Aldrich	221473-25G	Wytrawiacz do wytrawiania kołków rozwarstwiających
Rurki silikonowe	Tygon	14-169-1A	Rurka do podłączenia przetwornika pneumatycznego do uchwytu na pipety
Mikroskop stereoskopowy	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Służy do wizualizacji końcówek szpilek i podczas przygotowywania larw
Żyletka z prostą krawędzią	Canopus	Zamów od amazon.com	Przecina drut wolframowy podczas wykonywania kołków preparacyjnych
strzykawka	Becton Dickinson Compoany	309602	Wypełniony roztworem zewnątrzkomórkowym do wstrzyknięcia do elektrod rejestrujących
Pipeta transferowa	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Jednorazowa, niesterylna pipeta do przenoszenia larw
Metanosulfonian trikainy	Syndel powiedział:	Numer katalogowy: 12854	Farmaceutyczny środek przeciwzapalniczy stosowany do eutanazji larw w dużych dawkach.
Drut wolframowy	Światowe instrumenty precyzyjne Inc.	Numer telefonu 715500	0,002 cala, średnica 50,8 μm; używany do produkcji szpilek preparacyjnych
Jednostka filtracji próżniowej	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Jednorazowe, sterylne, próżniowe urządzenia filtracyjne służące do sterylizacji roztworu zewnątrzkomórkowego używanego do elektrofizjologii elektrody
Stopień czołowy z cęgami napięciowymi	Urządzenia molekularne	CV-7B (wersja cv-7B	Dostarczany ze wzmacniaczem MultiClamp 700B używanym jako lewy i prawy stopień główny
α-bungarotoksyna	Rybak termiczny	Zobacz materiał B1601	Do unieruchamiania larw przed rejestracją

szt. angielska) ) TGL )