Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Lunsford, E. T., et al. Aktywność neuronów doprowadzających tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie materiałów do zapisów elektrofizjologicznych

1. Zrób naczynie do nagrywania z dnem z elastomeru silikonowego.
   1. Dozuj cienką warstwę samomieszających się składników elastomeru silikonowego (np. Sylgard) do naczynia do hodowli tkankowych ze szklanym dnem, aż zrówna się z krawędzią płytkiej studzienki. Wystarczy około 0,5 ml.
   2. Przykryj i utwardź naczynie przez minimum 48 godzin w temperaturze pokojowej.

Wyniki

Ryc. 1: Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny aktywności neuronu doprowadzającego tylnej linii bocznej i brzusznego korzenia ruchowego. (A). Przykład elektrod rejestrujących z luźną plamą aferentną (i) i brzusznym korzeniem ruchowym (ii). Podziałka skali reprezentuje 50 μm. (B) Larwy danio pręgowanego są sparaliżowane i przypięte w.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zlewka 100 ml	Pyrex	1000	Resceptacle do wytrawiania
10x obiektyw do zanurzenia w wodzie	Olympus	UMPLFLN10xW	Małe powiększenie do pozycjonowania larw i elektrody rejestrującej
40-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzie	Olympus	LUMPLFLN40XW	Większe powiększenie dla końcówki elektrody pozycjonującej i ustanawiania zacisku krosowego
koncentryczne BNC	ThorLabs powiedział:	2249-C-12	Podłączanie kanałów wzmacniacza i digitizera; wymagane 4
Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem	Instrumenty Warnera	G150F-3	Średnica wewnętrzna: 0,86, średnica zewnętrzna: 1,50; szkło kapilarne służące do formowania elektrod rejestrujących
komputer	N/a	N/a	Każdy komputer powinien działać
Zasilanie prądem stałym	Tenma (Tenma)	Nr kat. 72-420	Służy do elektrycznego wytrawiania kołków preparacyjnych
Digitizer elektrofizjologii	Instrumenty aksonowe, urządzenia molekularne	Axon DigiData 1440A	Umożliwia pozyskiwanie danych typu patch-clamp
żarnik	Firma Sutter Instrument	Zobacz materiał FB255B	Filament pudełkowy 2,5 mm stosowany w ściągaczu do mikropipet
Cienkie kleszcze	Narzędzia naukowe	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Nr artykułu 11295-10	Służy do manipulowania larwami i wkładania szpilek
Mikroskop DIC ze stopniem stałym	Olympus	BX51WI	Mikroskop używany do wizualizacji i ustalania zapisów typu patch-clamp
Elastyczna, zwężająca się końcówka do pipet	Fisher Naukowy	02-707-169	Elastyczne końcówki umożliwiają wprowadzenie do elektrody rejestrującej w celu dozowania roztworu zewnątrzkomórkowego na końcówce
Naczynie FluoroDish	Światowe instrumenty precyzyjne Inc.	FD3510-100	Naczynie do nagrywania naczyń ze szklanym dnem
KimWipe (Czyszczenie Systemu)	KimTech (Technologia KimTech)	Numer katalogowy: 34155	Chusteczka zadaniowa służąca do odprowadzania nadmiaru płynu z larw
Kwik-Gard	Światowe instrumenty precyzyjne Inc.	710172	Samomieszający się elastomer sylgardowy
Wzmacniacz mikroelektrod	Instrumenty aksonowe, urządzenia molekularne	Zacisk MultiClamp 700B	Wzmacniacz z zaciskiem krosowym do nagrań dwukanałowych
Mikrokuźnia	Narishige powiedział:	Mikrokuźnia MF-830	Do polerowania elektrody nagrywającej
Jednostka sterująca mikromanipulatora	Siskiyou powiedział:	MC1000-eR/T	4-osiowy koordynator wybierania do sterowania mikromanipulatorem
Ściągacz do mikropipet	Firma Sutter Instrument	Płonący/Brązowy P-97	Do wciągania szkła kapilarnego do elektrod rejestrujących
Jednostka sterująca mikroskopu	Siskiyou powiedział:	MC1000e	Ustawia mikroskop wokół ustalonego stolika i przygotowania
Mikromanipulator z napędem silnikowym	Siskiyou powiedział:	MX7600 (wersja	Ustawia scenę główną i dołączoną elektrodę nagrywającą do nagrywania z zaciskiem krosowym
Sterownik MultiClamp	Urządzenia molekularne	2.2.2	Do pobrania ze strony pobierania Axon MultiClamp 700B Commander
Optyczny stół powietrzny	Korporacja z Newport	VH3036W-OPT	Stół izolacyjny na płytce stykowej do pływania mikroskopu i minimalizacji wibracji podczas nagrań
Zacisk pCLAMP	Urządzenia molekularne	Wersja 10.7.0	Do pobrania ze strony pobierania oprogramowania do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych Axon pCLAMP 10
Szalka Petriego	sokół	Nr kat. 35-3001	Służy do zanurzania larw w paralitach
Uchwyt na pipety	Urządzenia molekularne	1-HL-U	Przytrzymaj elektrodę nagrywającą i podłącz do sceny czołowej
Przetwornik pneumatyczny	Instrumenty biomedyczne firmy Fluke	DPM1B (Biblioteka DPM1B	Do kontrolowania ciśnienia wewnętrznego elektrody rejestrującej
Wodorotlenek potasu	Sigma-Aldrich	221473-25G	Wytrawiacz do wytrawiania kołków rozwarstwiających
Rurki silikonowe	Tygon	14-169-1A	Rurka do podłączenia przetwornika pneumatycznego do uchwytu na pipety
Mikroskop stereoskopowy	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Służy do wizualizacji końcówek szpilek i podczas przygotowywania larw
Żyletka z prostą krawędzią	Canopus	Zamów od amazon.com	Przecina drut wolframowy podczas wykonywania kołków preparacyjnych
strzykawka	Becton Dickinson Compoany	309602	Wypełniony roztworem zewnątrzkomórkowym do wstrzyknięcia do elektrod rejestrujących
Pipeta transferowa	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Jednorazowa, niesterylna pipeta do przenoszenia larw
Metanosulfonian trikainy	Syndel powiedział:	Numer katalogowy: 12854	Farmaceutyczny środek przeciwzapalniczy stosowany do eutanazji larw w dużych dawkach.
Drut wolframowy	Światowe instrumenty precyzyjne Inc.	Numer telefonu 715500	0,002 cala, średnica 50,8 μm; używany do produkcji szpilek preparacyjnych
Jednostka filtracji próżniowej	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Jednorazowe, sterylne, próżniowe urządzenia filtracyjne służące do sterylizacji roztworu zewnątrzkomórkowego używanego do elektrofizjologii elektrody
Stopień czołowy z cęgami napięciowymi	Urządzenia molekularne	CV-7B (wersja cv-7B	Dostarczany ze wzmacniaczem MultiClamp 700B używanym jako lewy i prawy stopień główny
α-bungarotoksyna	Rybak termiczny	Zobacz materiał B1601	Do unieruchamiania larw przed rejestracją

szt. angielska) ) TGL )