Pomiar dynamiki wywołanego stężenia jonów potasu w koronalnych wycinkach hipokampa

Streszczenie

Źródło: Octeau, J. C. et al. Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych dla jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka. J. Vis. Exp. (2018).

Film demonstruje wywołaną dynamikę stężenia jonów potasu podczas stymulacji elektrycznej wycinków mózgu myszy koronalnych hipokampów. Bipolarną elektrodę stymulującą umieszcza się w warstwie promieniowej regionu CA3 w hipokampie, a elektrodę selektywną jonów potasu umieszcza się w promieniu promieniowym warstwy CA1. Stymulacja elektryczna powoduje potencjał czynnościowy, w wyniku czego uwalniane są jony potasu. Wreszcie, brak wywołanej odpowiedzi jonów potasu w obecności cząsteczki hamującej potwierdza, że dynamika koncentracji jonów potasu jest spowodowana generowaniem potencjału czynnościowego w obokach Schaffera.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu hipokampa

1. Przygotowanie roztworów do krojenia
   1. Przygotuj 500 ml roztworu do cięcia sacharozy składającego się z: 194 mM sacharozy, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-glukozy, 1 mM MgCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄ i 26 mM NaHCO₃, 290-300 mOsm, nasyconych 95% O₂ i 5% CO₂.
   2. Przygotować 1-2 litry roztworu rejestrującego (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, ACSF) w składzie: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM D-glukozy, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄ i 26 mM NaHCO₃; pH 7,3 - 7,4 (po bulgotaniu), 290 - 300 mOsm, nasycone 95% O₂ i 5% CO₂. Napełnić zlewkę zawierającą komorę na plasterki mózgu roztworem do nagrywania i utrzymywać ją w temperaturze 32-34 °C. Napełnić komorę wibratomu lodowatą wodą błotną.
2. Przygotowanie ostrych plastrów
   1. Głęboko znieczul mysz, umieszczając ją w słoiku z dzwonkiem wstępnie naładowanym 2-3 ml izofluranu. Sprawdź, czy palce u nóg nie mają odruchu szczypania, a jeśli nie reagują, szybko odetnij mu głowę za pomocą ostrych nożyc lub gilotyny, zgodnie z protokołem dla zwierząt.
   2. Wykonaj 2-3 cm nacięcie za pomocą nożyc z ogonowej części czaszki, aby przeciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej. Ręcznie chowając skórę głowy, wykonaj dwa poziome nacięcia o długości 1 cm od otworu wielkiego wzdłuż boków czaszki. Następnie za pomocą cienkich nożyc wytnij nacięcie wzdłuż długości czaszki, wzdłuż linii środkowej od tyłu czaszki do nosa.
   3. Za pomocą cienkich kleszczy umieszczonych w pobliżu linii środkowej cofnij naciętą czaszkę na dwie części. Wyjmij mózg myszy z czaszki i użyj ostrza, aby usunąć móżdżek i opuszki węchowe, które znajdują się odpowiednio w ogonowej i rostralnej części mózgu. Można je zidentyfikować po dużych szczelinach, które oddzielają je od kory.
   4. Zamontuj blok mózgu na tacy z wibratomem za pomocą super kleju. Napełnij tacę wibratomu roztworem do cięcia na zimno.
   5. Wytnij skrawki tkanki na płaszczyźnie koronalnej o grubości 300 μm. Zwykle można zebrać 6 koronalnych wycinków hipokampa.
   6. Po odcięciu każdej sekcji należy natychmiast przenieść je do zlewki z ramką podgrzaną do temperatury 32–34°C. Przechowywać skrawki w tej temperaturze przez 20 minut przed wyjęciem zlewki zawierającej kawałki i umieścić ją w temperaturze pokojowej na co najmniej 20–30 minut przed zapisem.

2. Pomiar elektrycznie wywołanego K⁺ Dynamics

1. Ustawianie przygotowania plastrów
   1. Delikatnie umieść plasterek mózgu w kąpieli za pomocą pipety Pasteura i delikatnie przytrzymaj go na miejscu za pomocą platynowej harfy z nylonowymi strunami.
   2. Upewnij się, że końcówki bipolarnej elektrody stymulującej są równoległe do siebie i znajdują się na poziomie płaszczyzny plasterka. Powoli, w ciągu 6-7 sekund, włóż elektrody do warstwy promieniowania CA3 o głębokości około 40-50 μm, aby stymulować zabezpieczenia Schaffera. W przekrojach koronalnych CA3 można w przybliżeniu zidentyfikować jako część hipokampa właściwą bocznie do warstwy komórek ziarnistych w obrębie hipokampa, z warstwą promieniową opadającą przyśrodkowo i brzusznie do warstwy komórek piramidowych.
   3. Ostrożnie włóż elektrodę selektywną K⁺ do warstwy promieniowania CA1 na głębokości około 50 μm, powoli opuszczając elektrodę przez około 3-4 sekundy. Poczekaj, aż potencjał ustabilizuje się na elektrodzie przed zastosowaniem stymulacji do plasterka: zwykle zajmuje to od 5 do 10 minut. Jeśli wycinek wykazuje spontaniczne zmiany w zewnątrzkomórkowym K⁺, wyrzuć i powtórz ten proces z nowym plasterkiem.
2. Pomiar wywołanego uwolnienia K⁺
   1. Zastosuj ciągi stymulacji elektrycznej (8 impulsów), ręcznie naciskając spust na stymulatorze, jednocześnie cyfrowo rejestrując odpowiedzi. Zastosuj stymulację przy 10 Hz i szerokości impulsu 1 ms, zaczynając od amplitudy bodźca 10 μA.
   2. Stosuj zwiększające amplitudy stymulacji o współczynnik 2, aż do wykrycia maksymalnej amplitudy odpowiedzi K⁺. Jeśli nie widzisz żadnej odpowiedzi, przesuń pozycję elektrody K⁺ bliżej miejsca stymulacji w krokach co 100 μm
   3. Określ amplitudę bodźca, która wytwarza połowę maksymalnej odpowiedzi. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to od 40 do 160 μA, w zależności od jakości preparatu, wieku zwierzęcia i odległości między elektrodami stymulacyjnymi a elektrodą selektywną K⁺.
   4. W tym samym wycinku, stosując amplitudę bodźca o jeden krok niższą niż amplituda, która wytwarza odpowiedź połówkową maksymalną (np. jeśli 80 μA daje odpowiedź połówkową maksymalną, użyj 40 μA), zastosuj ciągi bodźców o rosnącej liczbie impulsów. Początkowo używaliśmy ciągów o 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 i 128 impulsach.
   5. Aby potwierdzić, że sygnały K⁺ są pośredniczone przez wyzwalanie potencjału czynnościowego elektrycznie stymulowanej kąpieli pobocznej Schaffera, należy zastosować 0,5 μM tetrodotoksyny (TTX) w ACSF przez 10 minut i powtórzyć protokół stymulacji. Nie należy zaobserwować żadnych wywołanych reakcji.
   6. Po zakończeniu eksperymentu z plastrem upewnij się, że elektroda zachowała swoją responsywność, ponownie kalibrując elektrodę w roztworach kalibracyjnych i upewniając się, że odpowiedź nie odbiega o więcej niż 10% od początkowej kalibracji

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wibratom	DSK	Mikrokrajalnica zero 1
Mysz: myszy wsobne C57BL/6NTac	Takonowy	Zbiór#B6
Mikroskop	Olimp	BX51
pCLAMP10.3	Urządzenia molekularne	n/a
Niestandardowa końcówka microfil 28G	Światowe instrumenty precyzyjne	CMF28G
Pręt wolframowy	Systemy A-M	716000
Bipolarne elektrody stymulujące	FHC	MX21XEW(T01)
Izolator bodźców	Światowe instrumenty precyzyjne	A365
Stymulator trawy S88	Firma Grass Instruments	S88
Pipety ze szkła borokrzemianowego	Światowe instrumenty precyzyjne	1B150-4
Tablica od A do D	Digidata 1322A	Instrumenty Axon
Wzmacniacz sygnału	Multiclamp 700A lub 700B	Instrumenty Axon
Scena główna	CV-7B Kat. 1	Instrumenty Axon
Łatka komputerowa	Dell	n/a
Chlorek sodu	Sigma	S5886
Chlorek potasu	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Wodorowęglan sodu	Sigma	S5761
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma	S0751
D-glukoza	Sigma	G7528
Chlorek wapnia	Sigma	21108
Chlorek magnezu	Sigma	M8266
Walinomycyna	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimetylo-3-nitrobenzen	Sigma	40870-25ml
Tetrakis potasu (4-chlorofenylo)boran	Sigma	60591-100mg
5% dimetylodichlorosilanu w heptanie	Sigma	85126-5ml
TTX	Firma chemiczna na Kajmanach	14964
Kwas solny	Sigma	H1758-500mL
Sacharoza	Sigma	S9378-5kg
Mikromanipulator do pipet	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Soczewka obiektywu	Olimp	PlanAPO 10xW