$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu hipokampa
- Przygotowanie roztworów do krojenia
- Przygotuj 500 ml roztworu do cięcia sacharozy składającego się z: 194 mM sacharozy, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-glukozy, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4 i 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, nasyconych 95% O2 i 5% CO2.
- Przygotować 1-2 litry roztworu rejestrującego (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, ACSF) w składzie: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukozy, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4 i 26 mM NaHCO3; pH 7,3 - 7,4 (po bulgotaniu), 290 - 300 mOsm, nasycone 95% O2 i 5% CO2. Napełnić zlewkę zawierającą komorę na plasterki mózgu roztworem do nagrywania i utrzymywać ją w temperaturze 32-34 °C. Napełnić komorę wibratomu lodowatą wodą błotną.
- Przygotowanie ostrych plastrów
- Głęboko znieczul mysz, umieszczając ją w słoiku z dzwonkiem wstępnie naładowanym 2-3 ml izofluranu. Sprawdź, czy palce u nóg nie mają odruchu szczypania, a jeśli nie reagują, szybko odetnij mu głowę za pomocą ostrych nożyc lub gilotyny, zgodnie z protokołem dla zwierząt.
- Wykonaj 2-3 cm nacięcie za pomocą nożyc z ogonowej części czaszki, aby przeciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej. Ręcznie chowając skórę głowy, wykonaj dwa poziome nacięcia o długości 1 cm od otworu wielkiego wzdłuż boków czaszki. Następnie za pomocą cienkich nożyc wytnij nacięcie wzdłuż długości czaszki, wzdłuż linii środkowej od tyłu czaszki do nosa.
- Za pomocą cienkich kleszczy umieszczonych w pobliżu linii środkowej cofnij naciętą czaszkę na dwie części. Wyjmij mózg myszy z czaszki i użyj ostrza, aby usunąć móżdżek i opuszki węchowe, które znajdują się odpowiednio w ogonowej i rostralnej części mózgu. Można je zidentyfikować po dużych szczelinach, które oddzielają je od kory.
- Zamontuj blok mózgu na tacy z wibratomem za pomocą super kleju. Napełnij tacę wibratomu roztworem do cięcia na zimno.
- Wytnij skrawki tkanki na płaszczyźnie koronalnej o grubości 300 μm. Zwykle można zebrać 6 koronalnych wycinków hipokampa.
- Po odcięciu każdej sekcji należy natychmiast przenieść je do zlewki z ramką podgrzaną do temperatury 32–34°C. Przechowywać skrawki w tej temperaturze przez 20 minut przed wyjęciem zlewki zawierającej kawałki i umieścić ją w temperaturze pokojowej na co najmniej 20–30 minut przed zapisem.
2. Pomiar elektrycznie wywołanego K+ Dynamics
- Ustawianie przygotowania plastrów
- Delikatnie umieść plasterek mózgu w kąpieli za pomocą pipety Pasteura i delikatnie przytrzymaj go na miejscu za pomocą platynowej harfy z nylonowymi strunami.
- Upewnij się, że końcówki bipolarnej elektrody stymulującej są równoległe do siebie i znajdują się na poziomie płaszczyzny plasterka. Powoli, w ciągu 6-7 sekund, włóż elektrody do warstwy promieniowania CA3 o głębokości około 40-50 μm, aby stymulować zabezpieczenia Schaffera. W przekrojach koronalnych CA3 można w przybliżeniu zidentyfikować jako część hipokampa właściwą bocznie do warstwy komórek ziarnistych w obrębie hipokampa, z warstwą promieniową opadającą przyśrodkowo i brzusznie do warstwy komórek piramidowych.
- Ostrożnie włóż elektrodę selektywną K+ do warstwy promieniowania CA1 na głębokości około 50 μm, powoli opuszczając elektrodę przez około 3-4 sekundy. Poczekaj, aż potencjał ustabilizuje się na elektrodzie przed zastosowaniem stymulacji do plasterka: zwykle zajmuje to od 5 do 10 minut. Jeśli wycinek wykazuje spontaniczne zmiany w zewnątrzkomórkowym K+, wyrzuć i powtórz ten proces z nowym plasterkiem.
- Pomiar wywołanego uwolnienia K+
- Zastosuj ciągi stymulacji elektrycznej (8 impulsów), ręcznie naciskając spust na stymulatorze, jednocześnie cyfrowo rejestrując odpowiedzi. Zastosuj stymulację przy 10 Hz i szerokości impulsu 1 ms, zaczynając od amplitudy bodźca 10 μA.
- Stosuj zwiększające amplitudy stymulacji o współczynnik 2, aż do wykrycia maksymalnej amplitudy odpowiedzi K+. Jeśli nie widzisz żadnej odpowiedzi, przesuń pozycję elektrody K+ bliżej miejsca stymulacji w krokach co 100 μm
- Określ amplitudę bodźca, która wytwarza połowę maksymalnej odpowiedzi. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to od 40 do 160 μA, w zależności od jakości preparatu, wieku zwierzęcia i odległości między elektrodami stymulacyjnymi a elektrodą selektywną K+.
- W tym samym wycinku, stosując amplitudę bodźca o jeden krok niższą niż amplituda, która wytwarza odpowiedź połówkową maksymalną (np. jeśli 80 μA daje odpowiedź połówkową maksymalną, użyj 40 μA), zastosuj ciągi bodźców o rosnącej liczbie impulsów. Początkowo używaliśmy ciągów o 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 i 128 impulsach.
- Aby potwierdzić, że sygnały K+ są pośredniczone przez wyzwalanie potencjału czynnościowego elektrycznie stymulowanej kąpieli pobocznej Schaffera, należy zastosować 0,5 μM tetrodotoksyny (TTX) w ACSF przez 10 minut i powtórzyć protokół stymulacji. Nie należy zaobserwować żadnych wywołanych reakcji.
- Po zakończeniu eksperymentu z plastrem upewnij się, że elektroda zachowała swoją responsywność, ponownie kalibrując elektrodę w roztworach kalibracyjnych i upewniając się, że odpowiedź nie odbiega o więcej niż 10% od początkowej kalibracji