$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
UWAGA: Nagrania z Q175 typu dzikiego (WT) i heterozygot (HETs) mogą być wykonywane w każdym wieku i każdej płci. Tutaj badaliśmy mężczyzn i kobiety w wieku od 51 do 76 tygodni.
1. Wstrzyknięcie czujnika glutaminianu iGluu do ekspresji w aksonach korowo-korowych
- Za pomocą ściągacza do pipet (tryb jednoetapowy) przygotuj pipety ze szkła borokrzemianowego do wstrzyknięcia wirusa. Po pociągnięciu należy ręcznie rozbić pipetę, aby uzyskać średnicę końcówki 30–50 μm. Autoklaw pipetę i narzędzia chirurgiczne, w tym wiertło do otwierania czaszki.
- Przechowywać wirusa AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/ml) w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 10 μl. Jeśli wstrzyknięcie jest wykonywane krótko po wytworzeniu wirusa (w ciągu 6 miesięcy), należy przechowywać w temperaturze 5 °C. Przed zabiegiem należy wyjąć fiolkę i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej.
- Napełnij szklaną pipetę i usuń wszelkie pęcherzyki.
- Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym roztworu zawierającego 87,5 mg/kg ketaminy i 12,5 mg/kg ksylazyny. Wstrzyknąć podskórnie 0,25% bupiwakainy (8 mg/kg) w celu dodatkowej ulgi w bólu. Sprawdź głębokość znieczulenia, monitorując napięcie mięśniowe i obserwując brak odruchów wywołanych bólem.
- Ogol skórę na głowie i wysterylizuj ją 70% alkoholem. Dopasuj mysz do ramki stereotaktycznej.
- Użyj skalpela, aby usunąć skórę i wiertła o dużej prędkości (38 000 obr./min), aby zrobić 1,2 mm otwór w kości nad korą ruchową.
- Zamontować strzykawkę z dołączoną pipetą iniekcyjną w uchwycie precyzyjnego manipulatora. Włóż pionowo zorientowaną pipetę do kory mózgowej w 4 różnych miejscach. Współrzędne iniekcji w stosunku do bregmy (w mm): przednia 1,5, boczna 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. Głębokość w stosunku do opony twardej wynosi (w mm): 1,5–1,7.
- Za pomocą systemu iniekcyjnego wstrzyknąć 0,3 μl na miejsce nierozcieńczonego roztworu wirusa z prędkością 0,05 μl/min. Po każdym wstrzyknięciu należy pozostawić pipetę na miejscu na 1 minutę, a następnie powoli ją wyjmować (1 mm/min).
- Na koniec zamknij ranę pooperacyjną nylonowym szwem.
- Pozostaw mysz na 0,5 do 1 godziny na poduszce grzewczej w czystej klatce przed powrotem do oryginalnej klatki.
- Utrzymuj mysz w 12-godzinnym cyklu dnia i nocy przez 6 do 8 tygodni przed przygotowaniem ostrych wycinków mózgu.
nuta: Aby uniknąć reakcji immunologicznych prowadzących do uszkodzenia komórek i utraty synaps, wstrzyknięcie wielu konstruktów wirusowych musi być wykonane jednocześnie lub w ciągu 2-3 godzin po pierwotnym wstrzyknięciu. Współrzędne do wstrzyknięcia iGluu zostały wybrane zgodnie z atlasem mózgu Paxinos i Franklina. Odpowiadają one korze ruchowej M1. Barwienie immunologiczne mózgów, którym wstrzyknięto implanty, uwidoczniło liczne, ale w większości dobrze izolowane aksony i żylaki aksonów w prążkowiu ipsi i przeciwległym oraz w przeciwległej korze M1 i S1.
2. Szukaj końcówek glutaminergiczne, które wyrażają czujnik glutaminianu iGluu
- Tryb kalibracji
- Przygotuj kamerę sCMOS i oprogramowanie sterujące kamerą z następującymi ustawieniami. Na stronie Odczyt ustaw Szybkość odczytu pikseli: 560 MHz (= najszybszy odczyt), Czułość/Zakres dynamiki: bit, Filtr szumów pozornych: Tak, Odczyt nakładania: Tak. Na stronie Binning/ROI wybierz opcję Pełny ekran.
- Przygotować szkiełko podstawowe zawierające kroplę 5 mg/ml Lucifer Yellow (LY) pod szkiełkiem nakrywkowym.
- Umieść suwak LY pod obiektywem 63x, otwórz migawkę lasera i wykonaj akwizycję szeregową przy użyciu następujących ustawień: Binning pikseli: 1x1, Tryb wyzwalania: wewnętrzny, Czas ekspozycji: minimalny (do ustalenia).
- Dostosuj moc lasera, aby wytworzyć plamkę fluorescencyjną o średnicy 4 μm (obraz nie powinien zawierać nasyconych pikseli).
- Aby przeprowadzić kalibrację systemu pozycjonowania laserowego, wybierz następujące ustawienia w oprogramowaniu do pozycjonowania laserowego: Średnica plamki: 10, Prędkość skanowania: 43.200 kHz. Kliknij przycisk Rozpocznij pobieranie obrazu w prawym panelu. Ustaw Przebiegi: 0, Opóźnienie uruchomienia: 0 i wybierz opcję Uruchom po wygaśnięciu na stronie Sekwencja. Kliknij przycisk Kalibruj na stronie Kalibracja i skalibruj oprogramowanie sterujące laserem zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w lewym górnym rogu ekranu akwizycji.
- Jeśli konfiguracja korzysta z niezależnego oprogramowania do sterowania kamerą i laserem, pobierz zrzuty ekranu z okna akwizycji kamery i wyślij je do oprogramowania sterującego laserem w celu ponownego obliczenia współrzędnych XY. Jeśli oprogramowanie jest zainstalowane na różnych komputerach, użyj narzędzia do przechwytywania wideo, aby zaimportować obraz do oprogramowania sterującego laserem. Oprogramowanie sterujące laserem będzie potrzebowało informacji o współczynnikach skalowania i przesunięciach XY. W tym celu należy określić współrzędne lewego górnego, lewego dolnego i prawego dolnego rogu obrazu w oknie akwizycji programu sterującego laserem. Oblicz współczynniki skalowania zgodnie z następującymi równaniami: współczynnik X = (X na dole w prawo – X w lewym dolnym rogu)/2048, przesunięcie X = X w lewo, współczynnik Y = (Y w lewym górnym rogu – Y na dole w lewo)/2048, przesunięcie Y = Y w lewym dolnym rogu.
- Na końcu procedury kalibracji utwórz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 267x460 pikseli, przesuń go na środek ekranu i kliknij przycisk Rozpocznij sekwencję.
- Wróć do następujących ustawień oprogramowania sterującego aparatem: Binning: 2x2, Tryb wyzwalania: Ekspozycja zewnętrzna, Czas ekspozycji: Minimalny (do ustalenia).
- Tryb korekcji autofluorescencji
UWAGA: Poziom spoczynkowy [Glu] w środowisku aktywnych zakończeń synaptycznych jest zwykle poniżej 100 nM. W związku z tym każdy czujnik glutaminianu, zwłaszcza czujnik o niskim powinowactwie, taki jak iGluu, będzie raczej przyciemniony przy braku uwalniania glutaminianu synaptycznego. Niemniej jednak pewna fluorescencja iGluu może być wykryta nawet w spoczynku, ale należy ją odróżnić od autofluorescencji tkankowej. Oświetlenie o długości fali 473 nm wywołuje zarówno fluorescencję iGluu, jak i autofluorescencję (rys. 1A–C). Ten ostatni zajmuje szeroki zakres długości fal, podczas gdy fluorescencja iGluu jest ograniczona do 480–580 nm (z maksimum przy 510 nm). Korekcja autofluorescencji opiera się na akwizycji dwóch obrazów z różnymi filtrami górnoprzepustowymi.
- Przygotuj plasterki mózgu z wyprzedzeniem, jak opisano w innym miejscu. Trzymaj plastry otrębów w gotowości.
- Przenieś plastry do komory rejestracyjnej, zanurzając je w utlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) zawierającym 125 mM chlorek sodu (NaCl), 3 mM chlorek potasu (KCl), 1,25 mM wodorofosforan sodu (NaH2PO4), 25 mM wodorowęglan sodu (NaHCO3), 2 mM chlorek wapnia (CaCl2), 1 mM chlorek magnezu (MgCl2), 10 mM glukozy (pH 7,3, 303 mOsm/L), uzupełnione 0,5 mM pirogronianu sodu, 2,8 mM askorbinianu sodu i 0,005 mM glutationu. Stosować natężenie przepływu 1–2 ml/min. Utrzymuj temperaturę kąpieli na poziomie 28–30 °C.
- Zlokalizuj prążkowie grzbietowe pod obiektywem 20-krotnego zanurzenia w wodzie. Przymocuj plastry nylonową siatką na platynowej harfie, aby zminimalizować ruch tkanki. Przełącz się na obiektyw 63x /NA 1.0 do zanurzenia w wodzie. Wybierz filtry odbijające światło o długości fali 473 nm (zwierciadło dichroiczne) i przechodzące światło o długości fali >510 nm (filtr emisyjny).
- Synchronizuj oświetlenie, stymulację i akwizycję obrazu za pomocą płytki analogowo-cyfrowej (AD)/cyfrowo-analogowej (DA) (AD/DA) z odpowiednim oprogramowaniem sterującym. Ustaw program wyzwalający tak, aby sterował akwizycją z czasem naświetlania lasera 180 ms i czasem akwizycji obrazu 160 ms. Użyj laserowego urządzenia pozycjonującego, aby wysłać wiązkę laserową do określonej liczby punktów i zdefiniować ustawienia prędkości skanowania i rozmiaru plamki.
- Uzyskaj obraz zarówno autofluorescencji, jak istruktur u-dodatnich iGlu za pomocą filtra górnoprzepustowego przy 510 nm ("żółty obraz").
- Uzyskaj obraz za pomocą samej autofluorescencji za pomocą filtra górnoprzepustowego przy 600 nm ("czerwony obraz").
- Skaluj obrazy czerwony i żółty, używając średnich intensywności 10 najjaśniejszych i 10 najciemniejszych pikseli, aby zdefiniować zakres. Wykonaj odejmowanie "żółty minus czerwony obraz" i przeskaluj odjęty obraz, aby wygenerować standardowy 8-bitowy plik tif dla wygodnej wizualizacji interesującego go obrazu (Rysunek 1D). Zawiera jasne piksele ze strukturu-dodatnich iGlu, szare piksele z tła i ciemne piksele ze struktur z autofluorescencją.
nuta: Przy danym sprzęcie średnia fluorescencja spoczynkowa (F) będzie poniżej 700 A.U.
- Tryb wyszukiwania Boutona
UWAGA: U-dodatnie piksele iGlu mogą należeć do funkcjonalnie różnych elementów drzewa aksonalnego, takich jak gałęzie aksonów różnego rzędu, miejsca rozwidlenia, żylaki po wyczerpaniu pęcherzyków lub w pełni aktywne żylaki. Jednak identyfikacja funkcjonalnych zakończeń synaptycznych jest prawie niemożliwa tylko na podstawie oględzin. Dlatego każdy glutaminergiczny koniec synaptyczny wymaga identyfikacji na podstawie jego reakcji na depolaryzację elektryczną. Strony, które nie reagują na stymulację, należy wyrzucić. Fizjologicznym sposobem indukowania uwalniania glutaminianu z aksonów korowo-prążkowych jest wywołanie potencjału czynnościowego. Można to osiągnąć za pomocą rodopsyny kanałowej o odpowiedniej charakterystyce spektralnej lub poprzez elektryczną stymulację aksonu wizualizowaną przez sam iGluu. Aby uniknąć przypadkowej aktywacji opsyny, wybraliśmy tę drugą metodę
- Za pomocą ściągacza do mikropipet (w trybie czterostopniowym) można wytwarzać pipety stymulacyjne z kapilar ze szkła borokrzemianowego. Wewnętrzna średnica końcówki powinna wynosić około 1 μm. Po napełnieniu ACSF rezystancja elektrody powinna wynosić około 10 MΩ.
- Aby indukować zależne od potencjału czynnościowego uwalnianie glutaminianu z zestawu bultonów synaptycznych przyłączonych do tego samego aksonu, użyj 63-krotnego powiększenia, filtra emisyjnego 510 nm i odjętego obrazu, aby umieścić szklaną elektrodę stymulacyjną obok fluorescencyjnego żylaku. Unikaj bliskości dodatkowych aksonów.
- Włącz stymulator, aby dostarczyć depolaryzujące impulsy prądu do pipety stymulacyjnej. Stosować natężenia prądu około 2 μA (nie więcej niż 10 μA).
- Włącz wielokanałowy system aplikacji kąpieli, w którym jeden kanał dostarcza standardowy roztwór do kąpieli, a drugi kanały dostarczają niezbędne blokery kanałów jonowych, transportery lub receptory błonowe. Kontroluj przepływ w miejscu rejestracji, a następnie przełącz się na kanał tetrodotoksyny (TTX) (roztwór do kąpieli plus 1 μM TTX). Po 2–3 minutach ponownie stymuluj interesujący nas bouton, ale tym razem przy braku generowania potencjału czynnościowego. Uwalnianie jest bezpośrednio spowodowane napływem wapnia przez kanały wapniowe zależne od napięcia.
- Przekręcając intensywności na stymulatorze, dostosuj prąd stymulacji, aby uzyskać reakcje podobne do tych wywoływanych przez potencjały czynnościowe. Zazwyczaj prąd stymulacji wynosi około 6 μA dla depolaryzacji 0,5 ms.
- Do podstawowych badań preparatu należy zastosować 0,5 mM CdCl2. Obecność tego blokera kanału wapniowego uwalniania glutaminianu całkowicie zapobiega synaptycznemu uwalnianiu glutaminianu, potwierdzając w ten sposób zależność od wapnia bezpośrednio wywołanego sygnału glutaminianu.
nuta: Poniższe ogólne zalecenie może pomóc w zwiększeniu wskaźnika powodzenia eksperymentów z pojedynczą synapsą w prążkowiu. Aby wybrać glutaminergiczne zakończenia synaptyczne z nienaruszoną maszynerią uwalniającą, żylak powinien: (i) mieć gładki kształt przypominający wrzeciono; (ii) nie być związane z bifurkacją aksonów; (iii) być jaśniejsze od innych struktur na "żółtym obrazie"; (iv) Przebywać w neuropilu prążkowia, a nie w drogach włóknistych; (v) Przebywać na bardzo cienkiej gałęzi aksonu; (vi) Nie mogą znajdować się w głębszych częściach kawałka.
3. Wizualizacja uwalniania i usuwania glutaminianu
- Tryb nagrywania
UWAGA: Po odjęciu autofluorescencji (krok 2.2) i kilku wstępnych testach na reakcję interesującego nas impulsu (krok 2.3), można rozpocząć akwizycję danych. Reakcje na elektryczną aktywację uwalniania glutaminianu z pojedynczych zakończeń aksonów można zaobserwować bezpośrednio na obrazie (ryc. 2), bez stosowania dalszych narzędzi analitycznych. Okazało się jednak, że bardzo wygodne jest natychmiastowe wyodrębnienie kilku podstawowych wskaźników wydajności synaps (ryc. 3). Informacje te są potrzebne do podejmowania decyzji o dalszym przebiegu eksperymentu, takich jak wybór poszczególnych typów terminali, szybka ocena zmian związanych z HD, liczba i częstotliwość prób lub leków, które mają być stosowane w systemie superfuzji. Może być również konieczne poradzenie sobie z ostatecznie pojawiającymi się artefaktami. Po pierwsze, opisano standardowe ustawienia zapisu danych.
- Korzystając z mikroskopowych napędów XY, umieść badany iGluu-dodatni bouton blisko środka viewfield. Zatrzymaj pobieranie obrazu za pomocą przycisku Przerwij pozyskiwanie. Na ostatnim uzyskanym obrazku określ pozycję XY spoczywającego centrum bouton, klikając na nie lewym przyciskiem myszy. Współrzędne XY ustawionego kursora zostaną pokazane w dolnym panelu stanu okna akwizycji.
- Korzystając z danych kalibracyjnych (krok 2.1.6), oblicz współrzędne miejsca, do którego powinna zostać wysłana wiązka laserowa w celu wzbudzenia fluorescencji iGluu. Użyj następujących równań: laser X = kamera X * współczynnik X + przesunięcie X, laser Y = przesunięcie Y – kamera Y * współczynnik Y. Podczas wykonywania tego przeliczania zwróć uwagę na ustawienia odwracania w pionie lub poziomie aparatu.
- Utwórz jednopunktową sekwencję w oprogramowaniu do sterowania laserem, korzystając z obliczonych współrzędnych. W tym celu wybierz opcję Punkt w polu Dodaj do sekwencji na stronie Sekwencja w oprogramowaniu do sterowania laserem. Wybierz 10 μs dla opóźnienia rozpoczęcia wyzwolenia i 180 ms dla czasu impulsu laserowego. Przesuń mysz do obliczonych współrzędnych i kliknij lewym przyciskiem.
- Wybierz następujące ustawienia w oprogramowaniu sterującym laserem: Przebieg: 0, Opóźnienie biegu: 0, Sekwencja: Uruchom z czasem wygaśnięcia. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij sekwencję.
- W oprogramowaniu do sterowania kamerą wybierz następujące ustawienia: Na stronie Binning/ROI ustaw Obszar obrazu: Niestandardowy, Binning pikseli: 2x2, Wysokość: 20, Szerokość: 20, Po lewej: współrzędna X spoczynkowegopunktu u-dodatniego iGlu minus 10 px, Dół: współrzędna Y spoczynkowegopunktu u-dodatniego iGlu minus 10 px, Tryb akwizycji: Seria kinetyczna, Długość serii kinetycznej: 400, czas ekspozycji: 0,0003744s (wartość minimalna). Przy takich ustawieniach szybkość akwizycji wyniesie 2,48 kHz.
- Wybierz Tryb wyzwalania: Zewnętrzny. Kliknij opcję Odbierz sygnał w oprogramowaniu do sterowania kamerą. Rozpocząć postępowanie w protokole doświadczalnym ustanowionym dla urządzenia spustowego.
- Wdrożenie protokołu eksperymentalnego Próba z następującą osią czasową: 0 ms – rozpoczęcie próby, 1 ms – rozpoczęcie oświetlenia laserowego, 20 ms – rozpoczęcie akwizycji obrazu za pomocą kamery, 70 ms – rozpoczęcie stymulacji elektrycznej 1, 120 – rozpoczęcie stymulacji elektrycznej 2, 181 ms – zakończenie próby (laser i kamera wyłączone). W ten sposób podczas jednej próby kamera rejestruje 400 klatek z częstotliwością 2,48 kHz. Patrz kroki 2.3.3 i 2.3.5. aby uzyskać szczegółowe informacje na temat stymulacji elektrycznej.
- Aby umożliwić wystarczającą regenerację puli pęcherzyków presynaptycznych, należy zastosować protokół Próba z częstotliwością powtarzania 0,1 Hz lub niższą.
- Budowa off-line przejściowego glutaminianu i szybka ocena uwalniania i klirensu glutaminianu w celu identyfikacji patologicznych synaps
- Włącz procedury oceny. Tutaj używamy napisanego przez nas oprogramowania SynBout v. 3.2. (autor: Anton Dworżak). Następujące kroki są potrzebne do skonstruowania stanu nieustalonego ΔF/F z pikseli o podwyższonej fluorescencji iGluu, jak na filmie na rysunku 2.
- Aby określić wielkość boutonu, należy obliczyć średnią i odchylenie standardowe (SD) intensywności fluorescencji ROI w spoczynku (F), przed rozpoczęciem stymulacji. Określ i obramuj obszar zajmowany przez piksele za pomocą średniej > f + 3 SD (rysunek 3A). Określ wirtualną średnicę (w μm) przyjmując okrągłą formę obszaru nadprogowego.
- Określ ΔF jako różnicę między wartością natężenia szczytowego a F. Wykreśl prąd stymulujący i ΔF/F w funkcji czasu (rysunek 3B). Obliczyć SD ΔF/F w spoczynku (przed rozpoczęciem stymulacji) i "amplitudę szczytową". Użyj piksela o amplitudzie piku większej niż 3 SD ΔF/F, aby wykonać monowykładnicze dopasowanie dla zaniku od szczytu. Wyznacz stałą czasową rozpadu TauD ΔF/F.
- Aby oszacować "Maksymalną amplitudę" w danej synapsie, wybierz piksel o najwyższej wartości ΔF/F. Zazwyczaj znajduje się w obrębie lub obok granic spoczynkowego bouton iGluu fluorescencji. "Maksymalna amplituda" byłaby najlepszym wskaźnikiem obciążenia glutaminianu prezentowanego maszynerii klirensu pojedynczej synapsy.
