Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Chirurgia
- Do zapisów elektrofizjologicznych użyj uretanu (UWAGA) do znieczulenia.
ostrożność: Uretan jest toksyczny i rakotwórczy, dlatego zawsze należy przestrzegać przepisów bezpieczeństwa i karty charakterystyki podanej przez producenta substancji.
- Przygotować roztwór 200 mg/ml uretanu w 0,9% roztworze soli fizjologicznej chlorku sodu (NaCl).
- Podawać dootrzewnowo (IP) łącznie 1,3 g/kg masy ciała uretanu. W zależności od szczepu szczura rozsądne może być podzielenie dawki na dwie dawki w 15-minutowym odstępie między wstrzyknięciami w celu zwiększenia bezpieczeństwa znieczulenia.
- Sprawdź głębokość znieczulenia, używając odruchu wycofania pedału i innych odpowiednich odruchów. Jeśli znieczulenie nie jest wystarczająco głębokie, aby wykonać operację, wstrzyknij 0,15 g/kg masy ciała uretanu IP i odczekaj kolejne 15 minut.
- Nałóż maść do oczu, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.
- Stale monitoruj częstość oddechów i odruch wycofania pedału podczas znieczulenia. Użyj poduszki grzewczej dla małych zwierząt z kontrolą temperatury, aby zapewnić utrzymanie fizjologicznej temperatury ciała przez cały czas trwania operacji. Przed rozpoczęciem zapisów elektrofizjologicznych należy zmienić na alternatywę nieelektryczną (np. podkładkę pod głowę z octanu sodu).
- Ogol futro wzdłuż grzbietowej strony głowy, aby uzyskać czyste pole operacyjne. Zdezynfekować okolice miejsca nacięcia odpowiednim chirurgicznym środkiem dezynfekującym. Zamocuj zwierzę w ramie stereotaktycznej.
- Wykonaj skalpelem nacięcie skóry głowy o długości 2 cm w kierunku strzałkowym. Za pomocą skalpela delikatnie zeskrob rozcięgno czaszki i zdezynfekuj czaszkę. Użyj patyczków kosmetycznych nasączonych 3% nadtlenkiem wodoru (H2O2), aby usunąć pozostałą tkankę.
- W razie potrzeby użyj elektrokautera lub termokautera, aby zatamować krwawienie. Należy zatamować krwawienia z kości czaszki i tkanki podskórnej, jeśli krwawienie nie ustanie samoistnie po 1-2 minutach i utrudnia widzenie w kierunku czaszki.
- Wyreguluj siekacz, aż głowa znajdzie się w płaskiej pozycji czaszki, co oznacza, że bregma i lambda jako stereotaktyczne punkty odniesienia znajdują się w tej samej płaszczyźnie. Jest to najważniejsze dla osiągnięcia wysokiej precyzji chirurgicznej. Użyj standardowego stereotaktycznego narzędzia do wyrównywania szczurów, skalibruj wyznaczoną końcówkę do bregmy pod mikroskopem i wyreguluj siekacz, aż wyznaczone punkty dla bregmy i lambdy na narzędziu dotkną czaszki w tym samym czasie.
nuta: Widok z jednej strony ze skupionym światłem z drugiej może pomóc w określeniu tego stanu. Alternatywnie, weź uchwyt stereotaktyczny z cienką kaniulą i zmierz grzbietowo-brzuszne współrzędne Bregmy i lambdy pod mikroskopem. Wyreguluj siekacz, aż współrzędne grzbietowo-brzuszne Bregmy i lambdy będą takie same.
- Użyj uchwytu stereotaktycznego z kaniulą, skalibruj do bregmy, a następnie oblicz położenie wszystkich wywierconych otworów w czaszce. Za pomocą uchwytu stereotaktycznego zaznacz pozycje otworów, które mają zostać wywiercone, ostrożnie drapiąc czaszkę lub używając kolorowego markera chirurgicznego. Współrzędne tego zależą od celów; współrzędne w odniesieniu do bregmy są podane dla szlaku hiperbezpośredniego w tabeli 1, w tym sugerowane współrzędne dla móżdżkowych elektrod referencyjnych.
- Za pomocą mikrowiertła ostrożnie wywierć wszystkie otwory. W przypadku jądra podwzgórzowego (STN) i siateczki substantia nigra pars (SNr) wywierć wspólny otwór (o wymiarach około 2 mm x 3 mm). Wszystkie inne otwory powinny mieć średnicę około 1 mm.
- Weź dwie cienkie kaniule (co najmniej 27 G) i zegnij ich końcówki, aby uformować haczykowaty kształt, używając twardej powierzchni lub pęsety. Użyj ich, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z wywierconych otworów, a następnie ostrożnie wytnij i usuń oponę twardą we wspólnym otworze STN/SNr.
- Przepłucz wywiercone otwory solą fizjologiczną. Nakładaj kroplę soli fizjologicznej co 15 minut na wywiercone otwory, aby zapobiec wysuszeniu mózgu i opony twardej.
- Weź mikrowiertło i pasującą mikrośrubę ze stali nierdzewnej (np. M 1,2 mm x 2 mm), wywierć otwór i wkręć mikrośrubę między otwory referencyjnych elektrod zewnątrzoponowych nad móżdżkiem, zrób to samo dla elektrod zewnątrzoponowych M1.
- Wsuń samodzielnie zbudowane elektrody zewnątrzoponowe Ag/AgCl w wywiercone otwory na elektrody referencyjne i elektrody M1. Poprowadź końcówkę elektrody za pomocą cienkiej pęsety i wsuń ją bezpośrednio pod kość czaszki do wywierconego otworu.
- Zamocuj wszystkie elektrody zewnątrzoponowe za pomocą dwuskładnikowego akrylu dentystycznego. Upewnij się, że nie zakrywasz punktu bregma ani nie wpływasz na wspólny otwór STN/SNr.
- Włóż przygotowany uchwyt z wolframowymi elektrodami mikrodrutowymi do ramki stereotaktycznej.
- Skalibruj najbardziej brzuszną elektrodę, która jest przeznaczona do kierowania STN, do bregmy. Dostosuj do obliczonej pozycji nad wspólnym otworem STN/SNr i opuść elektrody w dół do mózgu pod mikroskopowym widzeniem. Upewnij się, że elektrody wolframowe gładko wchodzą do mózgu.
2. Mapowanie elektrofizjologiczne i zapisy
UWAGA: Do tego kroku niezbędna jest klatka Faradaya i wielokanałowy system zapisu elektrofizjologicznego z oprogramowaniem do nagrywania zdolnym do filtrowania online i sortowania skoków online. Najlepiej używać systemu, który współpracuje z przedwzmacniaczem umieszczonym w pobliżu głowy zwierząt, aby ograniczyć szumy elektryczne i artefakty do absolutnego minimum. Oprócz wolframowych elektrod mikrodrutowych, do wykonywania zapisów szlaku hiperbezpośredniego niezbędna jest co najmniej jedna elektroda zewnątrzoponowa i jedna elektroda odniesienia. Zaleca się umieszczanie elektrod zewnątrzoponowych i referencyjnych parami, tak aby się nie stykały, co pomaga w przypadku nieprawidłowego działania i pozwala na różne rodzaje odniesień w analizie danych.
- Umieść mobilną klatkę Faradaya nad ramą stereotaktyczną. Jeśli dostępna jest tylko nieruchoma klatka Faradaya, ostrożnie przenieś ramkę stereotaktyczną do klatki Faradaya, upewniając się, że głębokie elektrody mózgowe nie są opuszczane do mózgu, dopóki ramka stereotaktyczna nie znajdzie się w swojej ostatecznej pozycji.
- Podłącz elektrody do stopnia głównego zestawu elektrofizjologicznego. Upewnij się, że elektrody referencyjne są podłączone do odpowiednich kanałów referencyjnych.
- Skonfiguruj oprogramowanie do nagrywania: Filtr pasmowo-przepustowy (0,05-8,000 Hz) i wzmocnij (wzmocnij 1,500-2,000x) surowy sygnał danych. Użyj internetowego filtra LFP i spajków z odpowiednimi ustawieniami (filtr pasmowoprzepustowy 0,05-250 Hz dla LFP, filtr pasmowoprzepustowy 300-8,000 Hz dla MUA). W przypadku wszystkich filtrów należy użyć filtra typu Butterworth.
- Skonfiguruj próg wartości szczytowej, jeśli ma to zastosowanie, dla sortowania wartości szczytowych online. Większość programów do nagrywania pozwala na ustawienie progu skoku, który jest wartością amplitudy, powyżej której sygnał jest oznaczany przez oprogramowanie jako skok. Próg ten można wyznaczyć matematycznie jako współczynnik lub odchylenie standardowe średniej amplitudy przefiltrowanego sygnału szczytowego lub preferować można go określić poprzez oględziny segmentów danych <500 ms i ustawić jako linię powyżej szumu sygnału w graficznym interfejsie użytkownika.
nuta: Intencją ustawienia progu spajków jest policzenie skoków i posortowanie jednostek w celu dostarczenia informacji o tym, ile neuronów jest obecnie rejestrowanych i jak kształtują się ich skoki.
- Powoli opuść elektrody wolframowe na 1 mm grzbietu celu, który jest STN dla szlaku hiperbezpośredniego. W razie potrzeby poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje.
- W celu mapowania elektrofizjologicznego należy przesunąć elektrody brzusznie w krokach co 100 μm. Na każdym kroku oceń wzór wypalania, szybkość wystrzeliwania i kształt kolców. Porównaj je z typowymi przykładami podanymi na rysunku 1. Zwykle gęste jądra wykazują szybkie i ciągłe wystrzeliwanie przez kilka stopni grzbietowo-brzusznych, podczas gdy struktury bogate w błonnik wykazują niskie tempo wypalania i mniej jednorodną aktywność kolców w kolejnych krokach brzusznych.
- W przypadku szlaku hiperbezpośredniego upewnij się, że najbardziej brzuszna elektroda znajduje się wewnątrz STN.
nuta: STN osiąga się, gdy wykryty zostanie znaczny wzrost MUA w brzusznej części Zona incerta. Brzusznie do STN, skoki zatrzymują się prawie całkowicie, ponieważ elektroda dotarła do wewnętrznej kapsułki. Gdy najbardziej brzuszna elektroda znajduje się w STN, konfiguracja mikroelektrod wolframowych zapewnia, że tylna, druga elektroda jest w SNr. Maksymalne dostrojenie brzuszne w małych przyrostach może być konieczne, aby zarejestrować typowe MUA w STN i SNr w tym samym czasie. Należy zauważyć, że częstotliwość MUA zależy od liczby faktycznie zarejestrowanych neuronów i od poziomu aktywacji mózgu.
- Gdy elektrody znajdą się w żądanych strukturach, skonfiguruj filtrowanie online i sortowanie impulsów (patrz rysunek 2), a następnie rozpocznij rejestrowanie danych. Typowe przykłady różnych stanów synchronizacji kory mózgowej, które można zidentyfikować w nagraniach LFP, przedstawiono na rysunku 3.
Tabela 1: Współrzędne stereotaktyczne do rejestracji szlaku hiperbezpośredniego korowo-podstawnego zwoju. Wszystkie punkty mierzy się od punktu odniesienia bregmy na czaszce w mm; n.d.- nie dotyczy.
pkt.
pkt.
jedn.
do
do
jedn.
jedn.
pkt.
pkt.
| Współrzędne z Bregmy | Stn | Snr | M1 | odniesienie 1 | odniesienie 2 |
| przednio-tylny | -3,6 | -4,8 | +3,0 | -10,0 | -10,0 |
| przyśrodkowo-boczny | +2,5 | +2,5 | +3,0 | +3,0 | -3,0 |
| grzbietowo-brzuszny | -8,0 | nie dotyczy | nie dotyczy | nie dotyczy | nie dotyczy |
