Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Codzienne przygotowanie aparatury doświadczalnej
- Włącz wzmacniacz, komputer i system kamery, a następnie sprawdź, czy oprogramowanie jest uruchomione.
- Umieść sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) w probówce o pojemności 50 ml i bąbelkuj karbogenem.
- Użyj pompy perystaltycznej do cyrkulacji ACSF. Dostosuj natężenie przepływu do około 1 ml/min.
- Wyreguluj wysokość pipety ssącej tak, aby poziom cieczy w komorze doświadczalnej był zawsze stały.
nuta: Poziom roztworu jest ważny dla uzyskania stabilnego zapisu, dlatego regulację należy wykonać za pomocą mikromanipulatora.
- Zainstalować elektrodę uziemiającą wykonaną z żółtego wióra wypełnionego 3 M agarem KCl (2%) w uchwycie z drutem Ag-AgCl z niewielką ilością roztworu 3 M KCl.
- Napełnij niewielką ilość ACSF (około dwóch trzecich objętości) szklaną elektrodą (1 mm średnicy zewnętrznej, 0,78 mm średnicy wewnętrznej pociągniętą ściągaczem do mikropipet) za pomocą zwężającej się cienkiej żółtej końcówki rurki i umieść ją w uchwycie elektrody.
- Przymocuj uchwyt do pręta zainstalowanego w manipulatorze. Upewnij się za pomocą amplifier, że rezystancja elektrody wynosi około 1 MΩ.
nuta: Elektroda krosowa z długim trzpieniem i szerokim otworem (4-8 μm) powinna być dobra do nagrywania w terenie i jako elektroda stymulująca.
2. Rozpoczynanie sesji nagraniowej
- Weź plasterek preparatu z wilgotnej komory za pomocą kleszczy.
- Szybko umieść plasterek w komorze doświadczalnej pod mikroskopem (Rysunek 1).
- Mocno wciśnij krawędź pierścienia w silikonowy O-ring. Uważaj, aby nie uszkodzić membrany ani dna komory doświadczalnej.
nuta: Kierunek warstwy powinien być brany pod uwagę w odniesieniu do kierunku elektrod stymulujących i rejestrujących w polu view. Zdrowy plasterek powinien przykleić się do filtra membranowego, aby nie było potrzeby używania innych urządzeń do mocowania plastrów, takich jak ciężarki i siatki nylonowe.
- Umieść końcówkę elektrody stymulującej i elektrodę rejestrującą potencjał pola na plastrze pod mikroskopem ze światłem przechodzącym.
- Użyj systemu rejestracji elektrofizjologicznej, aby sprawdzić odpowiedź. Potwierdź zwykły (niezabarwiony) zapis elektrofizjologiczny z podaną konfiguracją.
nuta: Elektrodę rejestrującą można pominąć, ale jest ona przydatna do sprawdzenia fizjologii wycinka.
- Dostosuj natężenie światła wzbudzającego do około 70-80% maksymalnej pojemności w kamerze, co odpowiada 13-15 mW/cm2 na próbce podczas próbkowania z częstotliwością 10 kHz za pomocą soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie 5x i soczewki tubowej 1x PLAN APO. Długość fali światła wzbudzenia wynosi 530 nm, a filtr emisyjny musi mieć > 590 nm.
nuta: Użyj migawki, aby zminimalizować ilość światła wzbudzającego. Ciągła ekspozycja na światło może pogorszyć fizjologię plastru. Ewentualny szkodliwy wpływ światła zależy od intensywności i czasu trwania światła. Użyj zapisu elektrofizjologicznego, aby ocenić wpływ światła. W przypadku wytrzymałości 13-15 mW/cm2 górną granicą tolerancji powinna być ekspozycja około 1 s.
- Dostosuj ostrość za pomocą systemu akwizycji za pomocą fluorescencyjnego źródła światła, ponieważ ostrość może być różna w zależności od długości fali i rozpocznij akwizycję.
- Sprawdź dane w oprogramowaniu do akwizycji obrazów.
nuta: Do szczegółowej analizy wykorzystaliśmy autorski pakiet mikroprogramistyczny oprogramowania do analizy numerycznej.
