Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wyrównanie ścieżki optycznej między kamerą CMOS (komplementarny półprzewodnik z tlenkiem metalu) a pojedynczym lub rozgałęzionym krosowym
- Poluzuj wszystkie na 5-osiowym translatorze (Rysunek 1B).
- Przykręć krosowy (Rysunek 1B) do adaptera [SMA (subminiatura A) lub FC (złącze światłowodowe)] przymocowanego do translatora 5-osiowego.
- Włącz lampę wzbudzenia 470 nm (rysunek 1B) przy niskiej mocy (100 μW) i umieść końcówkę patchcordu skierowaną w stronę autofluorescencyjnego szkiełka z tworzywa sztucznego. Nie ma to żadnego wpływu na przyszłe nagrania, ale służy wyłącznie do wizualizacji procesu wyrównywania.
- Nagrywanie z kamery CMOS (Rysunek 1B) w trybie na żywo. Zwiększ wzmocnienie lub dostosuj tabelę przeglądową (LUT), aż obraz nie będzie całkowicie. Chodzi o to, aby móc zobaczyć obraz w centralnym punkcie obiektywu (rysunek 1B).
- Przesuń 5-osiowy translator w kierunku obiektywu, upewniając się, że światło 470 nm jest wyśrodkowane na światłowodzie na końcu SMA lub FC krosowego, aż obraz będzie można rozwiązać w aparacie.
- Dostosuj osie X i Y, aż obraz zostanie wyśrodkowany i dobrze rozdzielony.
- Wizualizuj światło emitowane przez końcówkę tulejki krosowego. Powinien wyglądać jak okrąg izotropowy. Jeśli używany jest rozgałęziony krosowy, ilość światła emitowanego na końcach tulejki każdego krosowego powinna być podobna. Jeśli okrąg nie jest izotropowy lub emitowane światło jest nierówne, ustaw 5-osiowy translator w osi X-Y.
2. Ustawienie ROI wokół światłowodów do pomiaru średniej intensywności fluorescencji
- Włącz wszystkie światła wzbudzenia, aby lepiej uwidocznić włókna. Dostosuj wzmocnienie kamery tak, aby żadne piksele nie były nasycone i aby obecny był wyraźny obraz włókien.
- Nagraj na żywo lub zrób wstępny obraz.
- Narysuj ROI wokół włókien i zachowaj je do pomiaru średnich wartości intensywności podczas nagrań (rysunek 1A).
- W przypadku nagrań z wieloma światłowodami przetestuj niezależność sygnałów.
- Zapis na żywo ze wszystkich włókien.
- Skieruj jedno włókno w stronę źródła światła i postukaj palcem. Duże wahania powinny występować wyłącznie w tym kanale (dopuszczalny przeciek 1:1000).
- Jeśli sygnały nie są niezależne, przerysuj bardziej konserwatywne ROI i powtórz test niezależności.
- Aby oznaczyć i śledzić, który zwrot z inwestycji odpowiada któremu włóknu, kolorowej taśmie lub lakierowi do paznokci można nałożyć na koniec włókien. Zrób zdjęcie przed rozpoczęciem eksperymentu jako dodatkowe przypomnienie.
3. Konfiguracja areny nagrywania
- Zawieś krosowy nad areną za pomocą stojaków, clamps lub uchwytów.
- Upewnij się, że zwierzę może swobodnie poruszać się po całej arenie, nieskrępowane długością włókna.
- Jeśli używana jest skrzynka operacyjna lub otwarte pole, upewnij się, że krosowy może dotrzeć do zwierzęcia przy minimalnym zginaniu się. Jeśli wymaga to szturchnięcia nosa, upewnij się, że nad głową jest wystarczająco dużo miejsca, aby zapobiec zginaniu się włókna. Unikaj nadmiernego zginania lub skręcania krosowego.
4. Nagrania in vivo
- Sprawdź wzrokowo dystalny koniec włókien krosowego na oko i za pomocą mikroskopu z miniwłókien. Jeśli powierzchnia włókien jest porysowana, należy je ponownie wypolerować za pomocą folii do polerowania/docierania włókien o drobnej ziarnistości (1 μm i 0,3 μm).
- Wyczyść dystalne końce krosowego za pomocą 70% etanolu i aplikatora z bawełnianą końcówką.
- Wyczyść kaniule światłowodowe za pomocą 70% etanolu i aplikatora z bawełnianą końcówką.
- Podłącz końcówkę tulejki krosowego do wszczepionego włókna za pomocą ceramicznej dzielonej tulei pokrytej czarną rurką termokurczliwą. Upewnij się, że tuleja jest szczelna podczas połączenia. W przeciwnym razie użyj nowego rękawa.
nuta: Jeśli między skuwką krosowego a implantem jest jakakolwiek przestrzeń, nastąpi duża utrata sygnału, a nagrania nie będą działać.
- Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez kilka minut przed rozpoczęciem testów behawioralnych.
- Rozpocznij nagrywanie sygnału optycznego i przeprowadź eksperyment.
- Podczas nagrywania uważnie obserwuj ślad na żywo, aby zapewnić jakość nagrań. Oczekuje się, że sygnał gwałtownie spadnie w funkcji czasu w ciągu pierwszych 2 minut nagrywania. Efekt ten jest spowodowany zanikiem ciepła diody LED, w którym wzrost ciepła zwiększa rezystancję elementu optycznego.
- Jeśli nastąpi skok w sygnale, który wykracza poza kinetykę włączania/wyłączania GCaMP, często oznacza to, że tuleja nie jest wystarczająco szczelna, a przestrzeń między patchcordem a implantem zmienia się. W takim przypadku przerwij eksperyment i ponownie podłącz zwierzę za pomocą nowego rękawa.
