Badanie elektrofizjologiczne synaps retinogenikulacyjnych i kortykopochodnych w wycinkach mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Chen, X., et al. Badania elektrofizjologiczne funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogennych. J. Vis. Exp. (2019).

Film opisuje elektrofizjologiczny zapis synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych w wycinkach mózgu myszy. Plastry zawierające grzbietowe jądro kolankowate boczne (dLGN) umieszcza się w komorze rejestracyjnej. Pipetę stymulującą umieszcza się na przewodzie wzrokowym w celu stymulacji komórek zwojowych siatkówki (RGC) i zbadania synaps retinogenikulacyjnych lub jądra reticularis thalami w celu stymulacji neuronów korowych i zbadania synaps kortogenicznych. Po stymulacji RGC i neurony korowe uwalniają pobudzające neuroprzekaźniki, które wytwarzają prądy synaptyczne w neuronach przekaźnikowych LGN. Prądy te są rejestrowane za pomocą pipety rejestrującej z zaciskiem krosowym.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Rozwiązania

1. Roztwór do rozwarstwiania
   1. W celu zmniejszenia ekscytotoksyczności należy przygotować roztwór na bazie choliny, który będzie stosowany podczas sekcji, jak pokazano tutaj (w mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 chlorek choliny, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 0,5 CaCl₂, 7 MgCl₂ i 25 glukozy. Przygotuj roztwór preparacyjny mniej niż 1 tydzień przed eksperymentem.
2. Rozwiązanie do nagrywania
   1. Przygotować roztwór sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zawierający (w mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ i 25 glukozy. Dodać 50 μM kwasu D-2-amino-5-fosfonowalerinowego (D-APV) i 10 μM bromowodorku SR 95531 (gabazyny), aby zablokować odpowiednio receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) i GABAA.
3. Roztwór wewnątrzkomórkowy
   1. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy zawierający (w mM): 35 Cs-glukonianu, 100 CsCl, 10 kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES), 10-glikol etylenowy kwas tetraoctowy (EGTA) i 0,1 D-600 (chlorowodorek metoksywerapamilu). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą CsOH. Przefiltrować, podwielokrotność i przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

2. Sekcja

1. Przygotować dwie komory kromakowe, z których jedną wypełnia się 100 ml roztworu preparacyjnego, a drugą 100 ml roztworu rejestrującego. Umieścić dwie zlewki w łaźni wodnej (37 °C) i bąbelkować roztwory karbogenem przez co najmniej 15 minut przed rozbieraniem.
2. Napełnij plastikową zlewkę 250 ml prawie lodowatego (ale nie zamrożonego) roztworu preparacyjnego. Bąbelkować karbogenem co najmniej 15 minut przed użyciem.
3. Napełnij plastikową szalkę Petriego (100 mm x 20 mm), w której zostanie przeprowadzona sekcja mózgu, zimnym roztworem preparacyjnym. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej w pokrywie szalki Petriego.
4. Ostudzić komorę rozwarstwiającą wibratomu.
5. Znieczulić mysz 2,5% izofluranem, np. w klatce dla myszy. Gdy tylko mysz nie zareaguje na uszczypnięcie ogona, odetnij głowę myszy w pobliżu rdzenia szyjnego i zanurz głowę w lodowatym roztworze preparacyjnym u podstawy szalki Petriego.
6. Przetnij skórę głowy od ogona do nosa i trzymaj ją z boku palcami, aby odsłonić czaszkę. Aby usunąć przodomózgowie, najpierw przetnij czaszkę wraz z tylno-przednią linią środkową, a następnie przetnij jeszcze dwa razy szew koronalny i szew lambdoidalny (ryc. 1A).
7. Usuń czaszkę między szwem koronalnym a szwem lambdoidalnym tak, aby mózg był odsłonięty. Przeciąć opuszkę węchową i oddzielić przodomózgowie od śródmózgowia za pomocą cienkiego ostrza (ryc. 1B). Usuń mózg z czaszki cienką szpatułką i umieść go na bibule filtracyjnej w pokrywie szalki Petriego.
   nuta: Kroki 2.6 i 2.7 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby zmniejszyć śmierć komórki.
8. Aby zachować integralność sensorycznych i korowych wejść do dLGN w wycinku mózgu, oddziel dwie półkule cięciem przystrzałkowym pod kątem 3−5° (ryc. 1C, D). Osusz przyśrodkowo-boczne płaszczyzny obu półkul, umieszczając je na bibule filtracyjnej, a następnie przyklej je do stolika tnącego pod kątem 10−25° od płaszczyzny poziomej (ryc. 1E).
9. Umieść stolik na środku metalowej tacki buforowej i delikatnie wlej resztę lodowatego roztworu preparacyjnego do tacki buforowej. Wykonaj ten krok ostrożnie, ponieważ silne nalewanie może usunąć wklejony mózg (Rysunek 1F).
10. Umieść tackę buforową w tacce wypełnionej lodem, co pomaga utrzymać niską temperaturę podczas sekcji. Pokrój plastry o grubości 250 μm żyletką z prędkością 0,1 mm/s i amplitudą 1 mm.
11. Przechowywać plastry w komorze przetrzymywania wypełnionej natlenionym roztworem rozbiorowym w temperaturze 34 °C przez około 30 minut, a następnie pozostawić plastry do odzyskania w roztworze rejestrującym w temperaturze 34 °C przez kolejne 30 minut.
12. Po wyzdrowieniu wyjmij komorę na plastry z łaźni wodnej i przechowuj plastry w temperaturze pokojowej (RT) do czasu wykorzystania w eksperymentach.

3. Elektrofizjologia

1. Wyciągnij pipety za pomocą kapilar ze szkła borokrzemianowego i ściągacza do filamentu. Utrzymuj rezystancję pipet rejestrujących na poziomie 3−4 MΩ. Wyciągnij pipety stymulujące przy użyciu tego samego protokołu, ale po pociągnięciu lekko złamij końcówkę, aby zwiększyć średnicę. Napełnij pipety rejestrujące roztworem wewnątrzkomórkowym i biocytyną, jednocześnie napełniając pipety stymulujące roztworem rejestrującym.
2. Umieść plastry w komorze nagrywającej i ciągle perfunduj plastry natlenionym roztworem nagrywającym w temperaturze pokojowej. Sprawdź wszystkie plastry i wybierz te, które mają nienaruszony przewód wzrokowy.
3. Wizualizacja wycinka i komórek za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w mikroskopię wideo z kontrastem różnicowym w podczerwieni (IR-DIC).
   nuta: Neurony przekaźnikowe różnią się od interneuronów większym rozmiarem somy i większą liczbą dendrytów pierwotnych (gałęzi wyłaniających się z somy). Interneurony wykazują dwubiegunową morfologię z mniejszą somą.
4. Umieść pipetę stymulującą na plasterku przed załataniem komórki pipetą rejestrującą. Aby zbadać synapsy retinogenikulacyjne, umieść pipetę stymulującą bezpośrednio na przewodzie wzrokowym, gdzie włókna aksonowe z komórek zwojowych siatkówki są połączone (ryc. 2A). Aby przeanalizować synapsy kortykogeniczne, umieść elektrodę stymulującą na jądrze wzgórza reticularis, które przylega rostrobrzusznie do dLGN (ryc. 2B).
5. Po zanurzeniu pipety rejestrującej w roztworze rejestrującym należy zastosować krok napięcia 5 mV, aby monitorować rezystancję pipety. Ustaw potencjał podtrzymania na 0 mV i zanuluj potencjał przesunięcia tak, aby prąd podtrzymania wynosił 0 pA.
6. Zbliżyć się do celi z pipetą rejestrującą, stosując nadciśnienie. Gdy pipeta znajdzie się w bezpośrednim kontakcie z błoną komórkową, zwolnij nadciśnienie i ustaw potencjał utrzymywania na -70 mV. Zastosuj lekkie podciśnienie, aby błona komórkowa mogła przymocować się do szklanej pipety w taki sposób, aby powstało uszczelnienie gigaomowe (rezystancja >1 GΩ). Skompensuj pojemność pipety i otwórz celę za pomocą impulsów podciśnienia.
7. Aby zbadać funkcję synaptyczną, należy zastosować impulsy prądu o długości 0,1 ms (ok. 30 μA) za pomocą pipety do stymulacji. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych reakcji synaptycznych, może być konieczna wymiana pipet stymulujących. Zachowaj ostrożność podczas umieszczania pipet stymulujących w innej pozycji, aby nie utracić zarejestrowanej komórki.
   nuta: W przykładowych nagraniach pokazanych na rycinie 2 badano krótkotrwałą plastyczność synaptyczną poprzez dwukrotną stymulację przewodu wzrokowego lub włókien kortykopochodnych w odstępach między bodźcami wynoszących 30 ms. Stosunek parowanych impulsów (PPR) obliczono, dzieląc amplitudę drugiego wzbudzającego prądu postsynaptycznego (EPSC) przez amplitudę pierwszego EPSC (EPSC2/EPSC1). Każdy protokół stymulacji powtórzono 20 razy. Amplitudę EPSC zmierzono na podstawie średnich prądów z 20 przemiatania. Odstęp czasowy między każdym powtórzeniem wynosił co najmniej 5 s, aby uniknąć krótkotrwałej plastyczności wywołanej powtórzeniami.
8. Monitoruj rezystancję szeregową w sposób ciągły, stosując krok napięcia 5 mV. Do analizy należy używać wyłącznie ogniw o rezystancji szeregowej mniejszej niż 20 MΩ.

Wyniki

Rysunek 1: Schematy reprezentujące protokół sekcji. (A) Horyzontalny widok czaszki myszy, pokazujący położenie początkowych nacięć. Pierwsze cięcie wykonano wraz ze szwem strzałkowym, a następnie kolejne dwa cięcia wraz z szwem koronalnym i szwem lambdoidalnym. Linie przerywane reprezentują nacięcia. (B) Strzałkowy widok całego mózgu. Linie przerywane wskazują, że m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
wzmacniacz	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Wzmacniacz z podwójnym zaciskiem krosowym
CaCl2	PEWNOŚĆ	1.02382.1000
chlorek choliny	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Mikrosystemy Leica	TCS SP5 (wersja dodatkowa)
CsCl	PEWNOŚĆ	1.02038.0100
Cs-glukonian	Przygotowane samodzielnie		Ponieważ nie było komercyjnego Cs-glukonianu, przygotowaliśmy go sami
D-600	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M5644-50MG
D-APV (Kanał Dawczy	Trend biologiczny	Zobacz materiał BN0085-100
Aparat cyfrowy do mikroskopu O	Olympus	Zobacz materiał XM10
EGTA (EGTA)	SERVA	Numer katalogowy: 11290.02
glukoza	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPESY	Roth	9105.2
Izolator bodźców wysokoprądowych	Światowe instrumenty precyzyjne	Samolot A385
Kcl	PEWNOŚĆ	1.04936.1000
MgCl2	PEWNOŚĆ	Numer katalogowy: 1.05833.0250
Mikromanipulatory	Luigs & Neumann	Zobacz materiał SM7
Miroskop	Olympus	Zobacz materiał BX51
Medium montażowe	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał P36930
Zawartość NaCl	Roth	3957.1
NaH2PO4	PEWNOŚĆ	1.06346.1000
NaHCO3	PEWNOŚĆ	1.06329.1000
pipeta	Hilgenberg	1807502
Ściągacza	Sutter	Zobacz materiał P-1000
żyletka	Personna	60-0138
Półautomatyczny wibratom	Leica Biosystems	VT1200S
SR 95531 bromowodorek	Trend biologiczny	AOB5680-10	Antagonista receptora GABAA