Wszczepienie bezprzewodowego dwukierunkowego systemu mikroelektrod do mózgu szczura

Abstract

Źródło: Melo-Thomas, L., et al., Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do nagrywania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów. J. Vis. Exp. (2017)

Film demonstruje procedurę wszczepienia bezprzewodowej dwukierunkowej wielokanałowej elektrody do mózgu szczura w celu nagrywania i stymulowania wielokanałowych sieci neuronowych.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Zwierzęta

1. Dorosłe szczury Wistar (200-250 g) w grupach po 3-4 osoby w standardowych warunkach laboratoryjnych przez co najmniej tydzień przed operacją, aby umożliwić aklimatyzację.
2. Dwa dni po zabiegu szczury domowe w parach. Przykryj pojedyncze klatki wysokimi akrylowymi pokrywami. Unikaj konwencjonalnych pokrywek wykonanych z metalowej siatki, ponieważ implanty mogą utknąć, zwiększając ryzyko, że z czasem ulegną uszkodzeniu i/lub stanie się niestabilne.

2. Chirurgia stereotaktyczna

1. Przed przystąpieniem do zabiegu należy zorganizować i przygotować następujący sprzęt i materiały:
   1. Zaopatrz się w sterylny sprzęt chirurgiczny składający się ze sterylnych nożyczek, kleszczyków z końcami, szpatułek, maszynek do strzyżenia chirurgicznego, wiertła dentystycznego i patyczków kosmetycznych.
   2. Zaopatrz się w leki i chemikalia, w tym izofluran, ksylokainę, chlorowodorek tramadolu, maść do oczu dexpantenolu, 3% nadtlenek wodoru, jod powidonu i 70% etanol.
   3. Uzyskaj materiał mocujący, w tym ze stali nierdzewnej, żywicę akrylową, klej ultrafioletowy i osłonę nasadki.
   4. Otrzymać zespół mikroelektrody, składający się z (i) pojedynczej elektrody rejestrującej (mikroelektroda platynowo-wolframowa w izolacji szkłem kwarcowym, ze stożkowym kształtem końcówki, średnica zewnętrzna: 80 μm, końcówka stożkowa, impedancja przy 1 kHz: 500 kOhm) lub tetrody (4-żyłowa mikroelektroda platynowo-wolframowa w izolacji szkłem kwarcowym, średnica zewnętrzna: 100 μm, końcówka stożkowa, impedancja przy 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) elektroda stymulująca (drut platynowo-irydowy (90% platyny, 10% irydu), średnica rdzenia 125 μm, średnica zewnętrzna 150 μm, impedancja <10 kOhm) podłączona do płytki stykowej oraz (iii) elektroda referencyjna z drutu platynowego (średnica trzonu, 100 μm; Rysunek 1A).
   5. Zaopatrzyć się w uchwyt elektrody przyklejony klejem rozpuszczalnym w wodzie do zespołu mikroelektrod i przetestować działanie z co najmniej 2-godzinnym wyprzedzeniem (rysunek 1B).
   6. Uzyskaj konwencjonalny system na uwięzi składający się z przedwzmacniacza różnicowego, wzmacniacza głównego i wzmacniacza z filtrem pasmowo-przepustowym do nagrań.
   7. Zaopatrz się w dodatkowe materiały, takie jak rękawiczki, poduszka grzewcza, strzykawki i sól fizjologiczna.
   8. Zaopatrz się w klatki domowe (dł. x szer. x wys.: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
2. Procedura
   UWAGA: Wszczepienie elektrody wykonuje się podczas konwencjonalnej operacji stereotaktycznej w znieczuleniu izofluranowym.
   1. Upewnij się, że eksperymentator ma na sobie rękawiczki, maskę chirurgiczną i fartuch laboratoryjny.
   2. Znieczulenie należy rozpocząć od umieszczenia zwierzęcia w komorze indukcyjnej (izofluran 4-5%, przepływ tlenu 1 l/min, czas trwania ~5 min).
   3. Przetestuj utratę odruchów (odruchy ogona i palców u stóp) za pomocą kleszczy, aby potwierdzić głębokie znieczulenie.
   4. Umieść głowę zwierzęcia w masce anestezjologicznej zamocowanej wokół górnego pręta siekacza ramy stereotaktycznej i wyreguluj znieczulenie (izofluran 2-3%, przepływ tlenu 0,7-0,8 l/min).
   5. Zamocuj i wyrównaj głowę zwierzęcia w aparacie stereotaktycznym za pomocą nauszników i górnego siekacza.
   6. Ogolić pole operacyjne za pomocą maszynki do strzyżenia lub nożyczek i wysterylizować jodopowidonem.
   7. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii i potraktuj oczy maścią do oczu z dekspantenolu, aby zapobiec ich wysuszeniu.
   8. Wstrzyknąć ksylokainę (0,3-0,4 ml, podskórnie, s.c.) w środek pola operacyjnego.
   9. Ponownie przetestuj pod kątem utraty refleksu.
   10. Wykonaj małe nacięcie (1,5 cm) skalpelem na środku pola operacyjnego, aby odsłonić czaszkę. Delikatnie oddziel skórę i usuń resztki tkanki za pomocą kleszczy, nożyczek i szpatułki.
   11. Ostrożnie oczyść czaszkę za pomocą wacików pokrytych nadtlenkiem wodoru.
   12. Wywierć 4-5 małych otworów (4,7 mm) w czaszce do zamocowania ze stali nierdzewnej.
   13. Podłącz zespół mikroelektrody/uchwyt elektrody do przedwzmacniacza i podłącz go do stereotaktycznego mikromanipulatora (Rysunek 1B i 1C).
   14. Wywierć otwór (około 7 mm) w czaszce nad obszarem docelowym, używając współrzędnych z atlasu mózgu w zależności od użytego zwierzęcia. W niniejszym badaniu umieść końcówki elektrod skierowane do wzgórka dolnego, używając następujących współrzędnych, przy czym bregma służy jako odniesienie: przedni/tylny, −8,8 mm; przyśrodkowa/boczna, 1,5 mm; i grzbietowo-brzuszny, 3,5 mm.
   15. Wchłonąć krew za pomocą wacików.
   16. Wprowadź pionowo jednostkę mikroelektrod, aż końcówki elektrod dotrą do obszaru docelowego.
   17. Umieść uziemiający wzdłuż ze stali nierdzewnej i pod skórą.
   18. Monitoruj aktywność spajków i ostrożnie dostosuj położenie elektrody za pomocą mikromanipulatora, aż dotrzesz do strefy aktywnych neuronów w strukturze docelowej i wykryj aktywność neuronalną ze stosunkiem sygnału do szumu odpowiednim do sortowania spajków.
   19. Przymocuj jednostkę mikroelektrody do czaszki za pomocą kleju ultrafioletowego i przykryj płytkę stykową i żywicą akrylową.
   20. Wstrzyknąć sól fizjologiczną (1 ml i.p.) i tramadol (25 mg/kg s.c.), aby zapobiec odwodnieniu i zapewnić pooperacyjne działanie przeciwbólowe.
   21. Odłącz zespół mikroelektrody od uchwytu elektrody za pomocą szczotki nasączonej wodą.
   22. Przerwij znieczulenie i ostrożnie wyjmij szczura z ramy stereotaktycznej. Odłącz przedwzmacniacz od zespołu mikroelektrod.
   23. Podłączyć osłonę nasadki na wszczepionym zespole mikroelektrod i odłączać ją tylko podczas procedur eksperymentalnych.

Results

Rysunek 1: Zespół mikroelektrod TWS. (1) nagrywająca pojedyncza elektroda/tetroda, (2) elektroda stymulacyjna (3) płytka połączeniowa z włókna elektrody, (4) elastyczne połączeniowe, (5) przewód uziemiający, (6) płytka złącza, (7) złącze męskie lub żeńskie do systemu TWS (A); Zespół mikroelektrod TWS podłączony do przedwzmacniacza (8) i uchwytu (9); (B) gotowy do za...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
System bezprzewodowy Thomas (TWS) wersja 2.0	Thomas RECORDING GmbH	AN001165	Thomas Wireless System (TWS) w wersji 2.0 to przenośny wielokanałowy system telemetryczny z laptopem, preinstalowanym systemem operacyjnym Microsoft Windows i oprogramowaniem sterującym TWS. W skład TWS wchodzą: niskoszumowy 4-kanałowy pre- i programowalny wzmacniacz główny o stałej szerokości pasma, jednokanałowy stymulator stałoprądowy do aplikacji dwufazowych impulsów prądowych, programowalny programowo mikrostymulator, wszczepialny system złączy oraz podstawowa jednostka czołowa do montażu na zwierzęciu. System jest dostarczany z transceiverem z portem USB do laptopów lub komputerów stacjonarnych, oprogramowaniem sterującym działającym pod kontrolą systemu operacyjnego Microsoft Windows. System TWS może być wykorzystywany do zewnątrzkomórkowej stymulacji neuronalnej i rejestracji u swobodnie zachowujących się małych zwierząt (np. szczurów, świnek morskich). System ten można dostosować do stosowania również u większych zwierząt (np. naczelnych).
Oprogramowanie dla systemu bezprzewodowego Thomas (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	w AN001165	Oprogramowanie dla systemu bezprzewodowego Thomas działa pod kontrolą systemu operacyjnego Microsoft Windows i zapewnia graficzny interfejs użytkownika (GUI) dla systemu bezprzewodowego Thomas (TWS). TWS GUI oferuje pełną kontrolę nad funkcjami TWS, nagrywaniem 4-kanałowym i stymulacją 1-kanałową.
Wszczepialna tetroda do nagrywania (4 kanały) i stymulacji (pojedynczy kanał)	Thomas RECORDING GmbH	AN001132	Wszczepialna tetroda do nagrywania (4 kanały) i stymulacji (pojedynczy kanał) do użytku z systemami bezprzewodowymi Thomas (TWS). Specyfikacja tetrody nagrywającej: materiał włókna tetrodowego: włókno platynowe z izolacją ze szkła kwarcowego, średnica zewnętrzna włókna tetrodowego: 100 μm, kształt końcówki D, impedancja 0,5-0,8 MOHm; Elektroda referencyjna: kształt końcówki: D; Impedancja: 300-500kOhm; Materiał: izolowana platyną / wolframem kwarcowym; Specyfikacja elektrody stymulacyjnej: materiał włókna: platyna/iryd, średnica: 125μm, izolowany lakierem, kształt końcówki: D, impedancja: < 10kOhm, wymiary elektrody mogą być określone przez użytkownika końcowego
Wszczepialna mikroelektroda do rejestracji (pojedynczy kanał) i stymulacji (pojedynczy kanał)	Thomas RECORDING GmbH	AN001118	Wszczepialna mikroelektroda do rejestracji (pojedynczy kanał) i stymulacji (pojedynczy kanał) do użytku z systemami bezprzewodowymi Thomas (TWS). Specyfikacja elektrody rejestrującej: materiał włókna elektrody: włókno platynowe z izolacją ze szkła kwarcowego, średnica zewnętrzna włókna elektrody: 80 μm / 250 μm (proszę określić), kształt końcówki D, impedancja 0,5-0,8 MOHm; Elektroda referencyjna: kształt końcówki: D; Impedancja. 300-500kOhm; Materiał: izolowana platyną / wolframem kwarcowym; Specyfikacja elektrody stymulacyjnej: materiał włókna: platyna/iryd, średnica: 125μm, izolowany lakierem, kształt końcówki: D, impedancja: < 10kOhm
Uchwyt do implantacji elektrody	Thomas RECORDING GmbH	AN000838	Specjalny gięty metalowy pręt do implantacji mikroelektrod do standardowych uchwytów elektrod. Pręt służy do przytrzymywania elektrody wszczepialnej. Elektroda wszczepialna jest mocowana do pręta za pomocą specjalnego kleju rozpuszczalnego w wodzie Thomas RECORDING (AN001080). (Uchwyt elektrody nie jest dołączony)
Zapasowy zasilacz akumulatorowy do systemu bezprzewodowego Thomas (3,7V/230mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001208	Wymienny akumulator (akumulator) do systemu bezprzewodowego Thomas o pojemności 230mA na około 1h czasu pracy. (wymiary: 27mm x 20mm x 6mm, waga ok. 6g)
Zapasowy zasilacz akumulatorowy do systemu bezprzewodowego Thomas (3,7V/450mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001209	Wymienny akumulator (akumulator) do systemu bezprzewodowego Thomas o pojemności 450mA zapewniający czas pracy powyżej 1h. (wymiary: 48mm x 30mm x 4mm, waga ok. 11g)
Ładowarka akumulatora do akumulatora Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	AN001207	Ładowarka sieciowa do akumulatorów akumulatorowych Thomas Wirless System (TWS) (AN001209 i AN001209)
Klej rozpuszczalny w wodzie	Thomas RECORDING GmbH	AN001080	Rozpuszczalny w wodzie klej elektrodowy Thomas RECORDING to specjalnie dobrany produkt do stosowania z wszczepialnymi mikroelektrodami w badaniach neuronaukowych. Jego unikalne właściwości zapewniają sztywne połączenie między elektrodą a urządzeniem montażowym, chociaż można go łatwo usunąć ciepłą wodą. Rozpuszczalny w wodzie klej elektrodowy Thomas RECORDING może być używany od razu po wyjęciu z pudełka, bez czasochłonnego przygotowania. Rozpuszczalny w wodzie klej elektrodowy Thomas RECORDING nie jest szkodliwy dla ludzi, zwierząt ani środowiska. Ilość: 1 pudełko po 10 gramów
Miniaturowy przedwzmacniacz różnicowy	Thomas RECORDING GmbH	AN000329	Miniaturowy przedwzmacniacz różnicowy, model MDPA-2 to 2-kanałowy, różnicowy przedwzmacniacz wejściowy, który jest przeznaczony do nagrań o niskim poziomie szumów z pobudliwej tkanki. Jest przeznaczony do rejestracji zewnątrzkomórkowej w połączeniu z implantacją wszczepialnych mikroelektrod do swobodnie poruszających się zwierząt za pomocą systemu bezprzewodowego Thomas Wireless System (TWS). 2-kanałowy miniaturowy przedwzmacniacz różnicowy (MDPA-2) jest podłączony do wszczepialnych mikroelektrod w celu zapewnienia początkowego dziesięciokrotnego stopnia wzmocnienia. Idealnie byłoby, gdyby elektrody platynowo-wolframowe Thomas RECORDING z izolacją kwarcowym i szkłem kwarcowym zapewniały optymalne wyniki nagrywania przy wysokich amplitudach sygnału i niskim poziomie szumów. MDPA-2 posiada dodatkowe wejścia elektrod wspólnego uziemienia i odniesienia.
Przewód połączeniowy	Thomas RECORDING GmbH	AN000330	połączeniowy do podłączenia przedwzmacniacza różnicowego Thomas Miniature (MDPA-2) do wzmacniacza głównego i zasilacza akumulatorowego.
Akumulator do miniaturowego przedwzmacniacza	Thomas RECORDING GmbH	AN000328	Akumulatorowy zasilacz do miniaturowego przedwzmacniacza różnicowego (MDPA-2).
Ładowarka akumulatora (USA)	Thomas RECORDING GmbH	AN000167	Ładowarka akumulatora do AN000328 zasilającego (amerykański łącznik gniazdka sieciowego)
Ładowarka akumulatora (UE)	Thomas RECORDING GmbH	AN000168	Ładowarka akumulatorowa do AN000328 zasilającego (złącze gniazdka sieciowego UE)
Przedwzmacniacz różnicowy/wzmacniacz główny/filtr pasmowoprzepustowy	Thomas RECORDING GmbH	AN000677	Główny wzmacniacz TREC AC (LabAmp-03) to jednokanałowy, różnicowy wzmacniacz główny do zastosowań neurofizjologicznych (np. nagrywanie zewnątrzkomórkowe za pomocą mikroelektrod). Ten instrument jest przeznaczony do pracy z miniaturowym przedwzmacniaczem różnicowym, model MDPA-2. Pojedynczy kanał LabAmp-03 zawiera stopień wzmacniacza różnicowego o wysokim wzmocnieniu i niskim poziomie szumów, a następnie filtry niskich i wysokich częstotliwości. Wzmacniacz posiada dwa różne wzmacniacze filtrujące, wzmacniacz z filtrem pojedynczej aktywności (SUA) i wzmacniacz z filtrem o lokalnym potencjale pola (LFP), oba są połączone równolegle w ścieżce sygnałowej. Tryb nagrywania oferuje dwa poziomy wzmocnienia sygnału (x10, x100) w pierwszym stopniu i 4 dodatkowe poziomy (x5, x10, x25 i x50) w końcowym stopniu wzmacniacza. Każdy wzmacniacz ma inną charakterystykę pasmowoprzepustową dla aktywności pojedynczej jednostki (SUA) 500Hz...20kHz i lokalnych potencjałów pola (LFP) 0,1Hz...140Hz. W urządzeniu zintegrowany jest monitor audio i dyskryminator okienny. LabAmp-03 posiada zintegrowany monitor audio z głośnikiem. To urządzenie zapewnia odtwarzanie dźwięku sygnałów elektrofizjologicznych. Urządzenie łączy w sobie wzmacniacz audio w kompaktowej, wytrzymałej obudowie. Jest to szczególnie przydatne do monitorowania wypalania neuronów i skurczów mięśni. Wejście monitora audio jest wewnętrznie podłączone do SUA-Filter amplifier wyjście. LabAmp-03 jest dostarczany z zewnętrznym zasilaczem do zasilania sieciowego w zakresie napięcia 100-240V AC/50-60Hz.
Oscyloskop USB	Thomas RECORDING GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 kanały. Ten 2-kanałowy oscyloskop PC doskonale nadaje się do użytku mobilnego na laptopie i do stałej instalacji w szafach sterowniczych, urządzeniach przemysłowych i wielu innych zastosowaniach, w których wymagany jest mały, lekki i wydajny oscyloskop. Ten oscyloskop jest podłączony do wyjścia sygnału głównego wzmacniacza w celu wyświetlenia zarejestrowanej aktywności zewnątrzkomórkowej podczas implanacji wszczepialnych mikroelektrod dla systemu bezprzewodowego Thomas (TWS). Użytkownik może pobierać dane pomiarowe za pośrednictwem kilku interfejsów danych bezpośrednio na komputerze PC za pomocą dołączonego oprogramowania komputerowego.
Generator bodźców	Systemy wielokanałowe	STG3008-FA	Generator bodźców dla prądu (STG) i stymulacji sterowanej napięciem spełniają trzy funkcje: stymulację sterowaną prądem, stymulację sterowaną napięciem, sterowanie i czas. STG jest dostępny z 2, 4 lub 8 niezależnymi kanałami wyjściowymi. Wyposażony w zintegrowane jednostki izolacyjne dla każdego kanału wyjściowego, STG jest w stanie zapewnić dowolny przebieg.
Osłona nasadki na elektrodę	Thomas RECORDING GmbH	AN001193	Nasadka ochronna do wszczepialnego modułu elektrody do systemu bezprzewodowego Thomas
Sprzęt chirurgiczny			Nożyczki, kleszcze z końcami, szpatułki, maszynki do strzyżenia chirurgicznego, wiertło dentystyczne i patyczki kosmetyczne
Narkotyki i chemikalia			Izofluran, ksylokaina, chlorowodorek tramadolu (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Niemcy), maść do oczu dexpantenol (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Niemcy), 3% nadtlenek wodoru, powidon-jod (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Niemcy) i 70% etanol;
Materiał mocujący, w tym			ze stali nierdzewnej (BN650 M1,2x5; 4,7 mm), żywica akrylowa (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Niemcy), klej ultrafioletowy (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Niemcy) i osłona nasadki (Thomas Recording GmbH, Giessen, Niemcy);
Materiały dodatkowe			Rękawiczki, poduszka rozgrzewająca, strzykawki i sól fizjologiczna.
Przyrząd stereotaktyczny dla małych zwierząt (SASI)	Thomas RECORDING GmbH	AN000287	Model powinien być dobrany w zależności od zwierzęcia (szczur, świnka morska, małpy itp.) użytego w badaniu
Kamera wideo	EverFocus (Skupienie)		EverFocus, model: EQ150