$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Rozwiązania dla nagrań ostrych plasterków
- Przygotuj roztwory podstawowe 10x roztworu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4 i 11 mM D-glukozy) w czystej wodzie dejonizowanej. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C w butelce o pojemności 1 l bez CaCl2 i MgCl2.
- Przygotuj roztwór pipety na bazie glukonianu potasu, który zawiera 135 mM K-glukonianu, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 4 mM MgATP, 0,4 mM Tris-GTP, 10 mM Na2-fosfokreatyny i 2,7–7,1 mM biocytyny do ujawnienia morfologii komórek post hoc. Dostosuj pH roztworu do 7,3 i osmolarność do 290 mOsm. Przechowywać 1 ml porcji w temperaturze -20 °C.
2. Nagrywanie z użyciem zacisku krosowego całej komórki
- Delikatnie przenieś wycinek mózgu zawierający kompleks hipokampa za pomocą specjalnie wykonanej szklanej pipety transferowej do komory rejestracyjnej zamontowanej na pionowym mikroskopie. Pipeta transferowa składa się ze skróconej pipety Pasteura (średnica wewnętrzna 6,5 mm) przymocowanej do gumowej gruszki pipety. Ciągle perfekować komorę zapisu (3 ml) w temperaturze 34 °C (podgrzanej) aCSF bąbelkowany 95%/5% O2/CO2. Ustaw prędkość pompy perystaltycznej na 2-3 ml/min.
- Krótko zbadaj ekspresję Chronos-GFP w zakończeniach aksonów w obszarze zainteresowania przy niebieskim oświetleniu LED (470 nm) i obserwuj za pomocą obiektywu 4x. Fluorescencja GFP jest wizualizowana przez odpowiedni filtr emisyjny, a obraz z kamery CCD wyświetlany jest na ekranie komputera.
- Umieść na plasterku kotwicę wykonaną z platynowego drutu w kształcie litery U z ciasno rozmieszczonymi nylonowymi strunami ("harfą"), aby ją utrzymać.
- Zmień obiektyw na 63-krotny zanurzenie i wyreguluj ostrość. Sprawdź, czy w aksonach występuje ekspresja Chronos-GFP i wybierz neuron piramidowy do rejestracji łaty.
- Przesuń cel w górę.
- Wyciągnij pipety za pomocą ściągacza do elektrod Brown-Flaming ze szkła borokrzemianowego. Ściągacz jest przystosowany do produkcji pipet o średnicy końcówki około 1 μm. Napełnij pipety wewnętrznym roztworem na bazie glukonianu K.
- Zamontuj pipetę w uchwycie na pipetę na stoliku pod głowicę. Opuść pipetę w komorze i znajdź końcówkę pod obiektywem. Rezystancja pipety powinna wynosić od 3 do 8 MΩ. Zastosować lekkie nadciśnienie za pomocą strzykawki, tak aby zobaczyć stożek roztworu wypływający z pipety i stopniowo opuszczać pipetę i obiektyw do powierzchni plasterka.
- Umieść ogniwo w konfiguracji zaciskowej napięcia: zbliż się do zidentyfikowanego neuronu i delikatnie dociśnij końcówkę pipety do somy. Nadciśnienie powinno wytworzyć wgłębienie na powierzchni membrany. Zwolnij ciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie giga-omowe (rezystancja >1 GΩ). Po uszczelnieniu ustaw napięcie podtrzymania na -65 mV. Przerwij membranę ostrym impulsem podciśnienia: osiąga się to poprzez silne ssanie rurki podłączonej do uchwytu na pipety.
- Rejestruj w trybie cęgów prądowych całej komórki reakcje neuronu na hiperpolaryzujące i depolaryzujące kroki prądu (Rysunek 1A).
UWAGA: Ten protokół zostanie użyty do określenia aktywnych i pasywnych wewnętrznych właściwości komórki. Niestandardowe procedury MATLAB są używane do analizy off-line.
- Zapis w postsynaptycznych odpowiedziach cęgowych prądu lub napięcia na stymulację całego pola 475 nm LED włókien doprowadzających wyrażających Chronos. Stymuluj ciągami po 10 stymulacji trwających 2 ms przy 20 Hz (Rysunek 1 B, C). Natężenie światła może wahać się od 0,1 do 2 mW.
UWAGA: Natężenie światła mierzono za pomocą cyfrowej ręcznej konsoli mocy optycznej wyposażonej w czujnik fotodiodowy, umieszczony pod obiektywem. Opóźnienia odpowiedzi wynoszące 2–4 ms są charakterystyczne dla połączenia monosynaptycznego.
