Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie sprzętu i oprogramowania do nagrań wielokanałowych
- Skonfiguruj 16-kanałowy system akwizycji danych zgodnie z instrukcjami producenta.
nuta: Do zbierania nagrań wielokanałowych można wykorzystać kilka dostępnych na rynku wzmacniaczy i systemów akwizycji danych. W opisanych tu eksperymentach sygnały analogowe są dostarczane przez panel referencyjny elektrod do dwóch wzmacniaczy, gdzie są wzmacniane (2000x) i filtrowane (0,1-10kHz). Wejścia analogowe do systemu akwizycji danych są digitalizowane z częstotliwością 40kHz.
- Przymocuj odpowiednią 16-kanałową głowicę stage adapter do mikromanipulatora mikroskopu. Ustaw adapter tak, aby porty złącza żeńskiego były skierowane w dół.
- Wyreguluj kąt działania tego mikromanipulatora tak, aby był skierowany w dół w kierunku komory zapisu pod kątem około 70° w stosunku do poziomu.
- Podłącz wejście stopnia głównego do sondy 16 x 1 do elektrofizjologii in vitro za pomocą adaptera stopnia głównego zakotwiczonego w mikromanipulatorze.
- Podłącz złącze wyjściowe stopnia czołowego do systemu akwizycji danych.
- Zainstaluj odpowiednie oprogramowanie do pozyskiwania danych. Skonfiguruj 15 kanałów wejściowych tak, aby odpowiadały sygnałom wejściowym z pierwszych 15 wielokanałowych styków sondy. Skonfiguruj pozostały kanał, aby odbierał dane wejściowe z elektrody wewnątrzkomórkowej.
nuta: Podczas zbierania i analizowania danych należy wziąć pod uwagę mapy elektrod i adapterów, aby upewnić się, że odpowiedni sygnał odpowiada stykowi elektrody, z którego został zebrany.
2. Konfiguracja protokołów stymulacji światłem
- Skonfiguruj lekki system dostarczania i zainstaluj dołączone oprogramowanie.
- Otwórz oprogramowanie. Wybierz konfigurację okablowania sprzętowego, w której źródło wyzwalania (wyjście cyfrowe/TTL (logika tranzystorowo-tranzystorowa)) dostarcza sygnał wyzwalający do systemu dostarczania światła, a system dostarczania światła dostarcza sygnał wyzwalający do diody LED (diody elektroluminescencyjnej) 470 nm.
- Zamontuj soczewkę obiektywu o dużej mocy. Korzystając z aparatu cyfrowego, skalibruj obiektywy o dużej mocy z systemem dostarczania światła.
- Utwórz nową sekwencję profili stymulacji światłem.
- Utwórz wybrany wzór. W opisanych tutaj eksperymentach okrąg o średnicy 150 μm umożliwia specyficzną dla warstwy aktywację zakończeń aksonów.
- Aby utworzyć sekwencję profili, skopiuj i wklej ten profil dla każdej z dowolnej liczby prób.
- Utwórz listę przebiegów, która zawiera przebiegi o dowolnym natężeniu światła, czasie trwania impulsu lub liczbie impulsu.
- Losowo przypisz przebiegi do każdego profilu. Każdy profil z przypisanym mu kształtem fali odpowiada jednemu impulsowi wyzwalającemu z wejścia Digital TTL lub jednej próbie.
- Zapisz sekwencję profili.
- W oprogramowaniu do akwizycji danych utwórz nowy protokół.
- Ustaw liczbę prób tak, aby była równa liczbie profili w utworzonej sekwencji profili.
- Wybierz wejścia sygnału zgodne z tymi skonfigurowanymi w kroku 1.6. Skonfiguruj protokół, który zapewnia pojedyncze cyfrowe wyjście TTL, nagrywając z tych 16 kanałów wejściowych przez odpowiedni czas przed i po wyzwalaczu cyfrowym.
3. Umieszczanie sondy wielokanałowej w wycinku tkanki mózgowej ex vivo
- Perfuse bąbelkował eACSF (eksperymentalny sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy) (nie w szczelnie zamkniętych workach) w tempie 3-6 ml / min.
- Przenieś wycinek mózgu zawierający obszar zainteresowania na siatkę w komorze perfuzyjnej mikroskopu. Kotwica z platynową harfą
- Obróć siatkę siatki tak, aby linia styków elektrod na dystalnym końcu sondy wielokanałowej była w przybliżeniu prostopadła do powierzchni siatki.
- Opuść sondę wielokanałową w kierunku powierzchni plastra w świetle szerokiego pola i precyzyjnej kontroli mikromanipulatora.
- Obróć wieżyczkę kostki filtracyjnej, aby włączyć odpowiednią kostkę filtrującą w celu wizualizacji fluorescencyjnego białka reporterowego wyrażonego w zakończeniach aksonów korowych aferentów. W razie potrzeby obróć plasterek, aby dokładniej wyrównać sondę z powierzchnią pial.
- Umieść sondę tuż nad płaszczyzną wycinka, ~200 μm przed ostateczną pozycją docelową wzdłuż osi x, pozostawiając co najmniej jeden kanał poza granicą rejestrowanego obszaru tkanki.
- Powoli włóż sondę do plastra, przesuwając manipulator wzdłuż jego osi podłużnej. Aby zminimalizować uszkodzenia tkanki, przesuwaj sondę tylko do tego stopnia, aby ostre końcówki były widoczne tylko pod powierzchnią tkanki. Zminimalizuje to uszkodzenia tkanki, jednocześnie zapewniając, że styki elektrod stykają się z tkanką.
4. Łatka zaciskająca wybrane neurony i uzyskująca konfigurację całej komórki
- Przełącz źródło eACSF na workowane rozwiązanie sterujące.
- Zidentyfikuj komórki znakowane fluorescencyjnie w celu ukierunkowanego nagrywania zacisków krosowych.
- Ogranicz przysłonę przysłony przysłony do najmniejszej średnicy. Włącz soczewkę obiektywową o małej mocy i ustaw ostrość na tkance.
- Wyśrodkuj światło na obszarze tkanki przylegającym do sondy wielokanałowej (ale nie nakładającym się
na nią).
- Włącz obiektyw zanurzeniowy o dużej mocy (40x lub 60x), zachowując ostrożność, aby uniknąć kontaktu między sondą wielokanałową a soczewką obiektywu.
- Obróć wieżyczkę kostki filtracyjnej, aby włączyć odpowiedni zestaw filtrów, aby umożliwić obrazowanie komórek wyrażających marker fluorescencyjny zależny od Cre.
- Zidentyfikuj fluorescencyjnie znakowaną komórkę jako cel do nagrywania patch clamp. Podnieś soczewkę obiektywu, aby uzyskać wystarczająco dużo miejsca na opuszczenie pipety z plastrem.
- Załadować pipetę z plastrem (patrz Tabela 1) roztworem wewnętrznym (Tabela 2) i zamontować pipetę w uchwycie elektrody. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml zastosuj nadciśnienie odpowiadające ~0,1 ml powietrza.
- Zanurzyć pipetę z plastrem w roztworze. Ustaw ostrość końcówki pipety zgodnie ze wskazówkami wizualnymi.
- Uzyskaj zapis całej komórki z komórki docelowej, wykonując czynności opisane wcześniej33.
- Jeśli planujesz ocenić zmiany wewnętrznych właściwości ogniwa (np. rezystancji wejściowej, szybkości wyzwalania potencjału czynnościowego w odpowiedzi na bieżące kroki), przeprowadź te zapisy. W przeciwnym razie przejdź do poniższego protokołu stymulacji aksonów.
Tabela 1: Skład sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego i roztworu wewnątrzkomórkowego. Wymieniono odczynniki i stężenia dla eACSF oraz wewnątrzkomórkowy roztwór pipet do zapisów z zaciskiem krosowym.
powiedział:
Rozdział
powiedział:
powiedział:
szt.
| Doświadczenie ACSF, eACSF (w mM) |
| Zawartość NaCl | Rozdział 111 |
| NaHCO3 | 35 |
| HEPESY | 20 |
| Kcl | 1.8 |
| CaCl2 | 2.1 |
| MgSO4 | 1.4 |
| KH2PO4 | Rozdział 1.2 |
| glukoza | 10 |
| Rozwiązanie wewnętrzne |
| K-glukonian | 140 |
| Zawartość NaCl | 10 |
| HEPESY | 10 |
| EGTA (EGTA) | 0,1 |
| MgATP (MgATP) | 4 |
| NaGTP (Protokół NaGTP) | 0,3 |
| pH = 7,2 |
