Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowania przedoperacyjne
- Przygotowanie roztworu elektrody
- Aby przygotować roztwór zasypki elektrody, należy przygotować roztwór 4 M octanu potasu ze 140 mM chlorku potasu.
- Przygotowanie elektrod
- Za pomocą odsysania próżniowego włóż włókno węglowe T-650 (o średnicy 7 μm) do kapilary ze szkła borokrzemianowego (długość = 100 mm, średnica = 1,0 mm, średnica wewnętrzna = 0,5 mm).
- Po umieszczeniu włókna węglowego w szklanej kapilarze umieść szklaną kapilarnę w pionowym ściągaczu elektrod, tak aby element grzejny znajdował się mniej więcej pośrodku kapilary. Ustaw grzałkę na 55 przy wyłączonym magnesie.
- Po pociągnięciu kapilary ostrożnie podnieś górny uchwyt kapilarny, aby końcówka elektrody nie była otoczona elementem grzejnym.
- Za pomocą ostrych nożyczek odetnij włókno węglowe, które nadal łączy dwa kawałki kapilary. W ten sposób powstaną dwie oddzielne mikroelektrody z włókna węglowego.
- Pod mikroskopem świetlnym ostrożnie przetnij odsłonięte włókno węglowe ostrym skalpelem tak, aby wystawało około 75-100 μm poza koniec szkła.
- Używając mikroskopu świetlnego, upewnij się, że elektroda jest wolna od pęknięć wzdłuż kapilary i że uszczelka, w której włókno węglowe wychodzi z kapilary, jest trudna do zauważenia i wolna od pęknięć.
nuta: Dobre uszczelnienie pomoże zredukować szumy podczas nagrań.
- Produkcja elektrod referencyjnych
- złotą szpilkę do 5 cm srebrnego drutu.
- Przymocuj anodę do metalowego spinacza do papieru lub innego przewodnika, katodę do kołka i przyłóż napięcie (~2 V), podczas gdy spinacz do papieru i srebrny drut są zanurzone w 0,1 M HCl.
- Zatrzymaj napięcie, gdy na srebrnym przewodzie pojawi się biały nalot (AgCl).
- Przygotowanie elektrod do implantacji
- złoty szpilkę do cienkiego izolowanego drutu (~10 cm długości, <0,50 mm średnicy).
- Usuń ~5 cm izolacji z przewodu naprzeciwko złotego pinu.
- Napełnij elektrodę mniej więcej do połowy roztworem elektrody.
- Włóż izolowany drut do elektrody.
nuta: Drut powinien stykać się z włóknem węglowym wewnątrz elektrody.
2. Implantacje elektrod
- Dorosłym szczurom Sprague Dawley (250-450 g) należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie (1,5 g/kg lub 1 ml/kg objętości) 0,5 g/ml uretanu rozpuszczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Rozpocząć od początkowej dawki uretanu 1,0-1,2 g/kg. Jeśli zwierzę nadal reaguje na test szkodliwego bodźca (uszczypnięcie ogona) 20 minut po podaniu uretanu, należy podać dodatkowe 0,3−0,5 g/kg uretanu w całkowitej dawce 1,5 g/kg.
nuta: Aby przygotować roztwór uretanu o stężeniu 0,5 g/ml, dodaj 10 g uretanu do 10 g (~10 ml) soli fizjologicznej. Uretan jest czynnikiem rakotwórczym i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Jest to jednak ważny środek znieczulający, ponieważ nie zmienia poziomu dopaminy, podobnie jak inne środki znieczulające, takie jak ketamina/ksylazyna i hydrat chloralu.
- Gdy zwierzę jest głęboko znieczulone i nie reaguje na szkodliwe bodźce (np. szczypanie palców u nóg), umieść je w ramce stereotaktycznej. Nałóż lubrykant okulistyczny na każde oko szczura.
nuta: Jest to operacja, która nie daje szans na przeżycie, ale zaleca się stosowanie dobrej techniki aseptycznej.
- Oczyść skórę głowy szczura za pomocą dwuetapowego peelingu (tj. peelingu jodopowidonowego, a następnie peelingu 70% etanolu; wykonuj z 3-cyklowym powtórzeniem).
- Odetnij tkankę skóry głowy za pomocą wysterylizowanej pęsety igłowej i nożyczek chirurgicznych. Usuń znaczną ilość tkanki, aby zrobić miejsce na różne implantacje opisane poniżej.
- Delikatnie oczyść powierzchnię czaszki za pomocą wysterylizowanych aplikatorów z bawełnianą końcówką. Następnie nałóż 2-3 krople 3% nadtlenku wodoru, aby pomóc zidentyfikować lambdę i bregmę.
- Za pomocą wiertarki stereotaktycznej lub ręcznej (1.0 mm, ~20 000 obr./min) wywierć otwór o średnicy 1.5 mm 2.5 mm przed bregmą i 3.5 mm bocznie do bregmy. Częściowo (mniej więcej w połowie, aż znajdzie się na swoim miejscu) wbij (1,59 mm średnicy zewnętrznej, 3,2 mm długości) w ten otwór. Zaleca się stosowanie sterylnej soli fizjologicznej do nawadniania podczas wiercenia, aby zapobiec urazom termicznym.
- W przypadku elektrody referencyjnej wywierć otwór o średnicy 1.0 mm 1.5 mm z przodu i 3.5 mm z boku do bregmy, w lewej półkuli.
- Ręcznie włóż ~2 mm przewodu odniesienia do tego otworu, owijając przewód odniesienia wokół i pod wszczepionej.
- Całkowicie wkręć, przytrzymując elektrodę referencyjną na miejscu.
- W prawej półkuli wywierć otwór o średnicy 1,5 mm 1,2 mm z przodu i 1,4 mm z boku bregmy.
- Delikatnie usuń oponę twardą za pomocą pęsety.
- W przypadku elektrody stymulującej wywierć kwadratowy otwór (2 mm przednio-tylny, 5 mm przyśrodkowo-boczny) wyśrodkowany na 5,2 mm z tyłu i 1,0 mm z boku bregmy.
- Za pomocą stereotaktycznych prętów naramiennych opuść bipolarną elektrodę stymulującą/kaniulę prowadzącą 5 mm poniżej opony twardej. W przypadku krwawienia podczas implantacji elektrody należy użyć sterylnych wacików bawełnianych i gazy, aby zminimalizować krwawienie.
nuta: Dwubiegunowa elektroda stymulująca stosowana w tej metodzie jest wstępnie wyposażona w kaniulę prowadzącą (tabela materiałów). Wewnętrzna kaniula używana z tym elementem powinna być przepłukana zębami bipolarnej elektrody stymulującej po całkowitym włożeniu do kaniuli prowadzącej. Pozwoli to na to, aby kaniula wewnętrzna znalazła się bezpośrednio między dwoma bolcami stymulatora, które są oddalone od siebie o około 1 mm. Podobny protokół jest opisany w innym miejscu.
- Korzystając ze stereotaktycznych prętów ramienia, opuść mikroelektrodę z włókna węglowego 4 mm poniżej opony twardej. To miejsce znajduje się w najbardziej grzbietowej części prążkowia.
- Podłącz przewód odniesienia i włókno węglowe do potencjostatu.
- Zastosuj przebieg trójkątny (-0,4−1,3 V, 400 V/s) przez 15 minut przy 60 Hz i ponownie przez 10 minut przy 10 Hz.
nuta: Zazwyczaj, podczas nakładania fal na mikroelektrody z włókna węglowego w mózgu, grupy tlenkowe są dodawane do powierzchni włókna węglowego. Równowaga tej reakcji musi być osiągnięta przed rejestracją; W przeciwnym razie dojdzie do znacznego dryfu19. Cykliczne obracanie elektrody przy wyższych częstotliwościach (60 Hz) pozwala włóknu węglowemu szybciej osiągnąć równowagę.
3. Optymalizacja włókna węglowego i stymulowanie lokalizacji elektrod/kaniuli prowadzącej
- Ustaw stymulator tak, aby wytwarzał bipolarny przebieg elektryczny o częstotliwości 60 Hz, 24 impulsach, prądzie 300 μA i szerokości impulsu 2 ms/fazę.
- Delikatnie obniżaj stymulator w odstępach co 0,2 mm od 5 mm do 7,8 mm poniżej opony twardej. Przy każdym kroku stymuluj VTA.
nuta: Na większej głębokości grzbietowej (5-6 mm) stymulacja mózgu zazwyczaj (~ 80% czasu) powoduje drganie wąsów szczura. Na dalszych głębokościach wąsy przestaną drgać, co następuje między 7,5−8,2 mm poniżej opony twardej. Kiedy wąsy przestaną drgać, elektroda stymulująca znajdzie się w pobliżu lub na VTA. Nie wystąpi to u każdego szczura, a brak drgania wąsów nie powinien być traktowany jako znak, że dwubiegunowa elektroda stymulująca/kaniula infuzyjna jest źle umieszczona. Drganie wąsów może nie wystąpić w przypadku wszystkich środków znieczulających (np. izofluranu).
- Kontynuuj obniżanie bipolarnej elektrody stymulującej/kaniuli prowadzącej, aż stymulacja spowoduje fazowe uwolnienie DA na mikroelektrodzie z włókna węglowego (obecnie w prążkowiu grzbietowym).
nuta: Uwolnienie DA w prążkowiu grzbietowym nie zawsze nastąpi, jeśli elektroda bipolarna zostanie wszczepiona do VTA, ale obserwacja uwolnienia DA w prążkowiu grzbietowym po stymulacji VTA jest zwykle dobrym znakiem, że dobry sygnał zostanie zaobserwowany w rdzeniu NAc.
- Opuść mikroelektrodę z włókna węglowego, aż znajdzie się co najmniej 6.0 mm poniżej opony twardej. Jest to najbardziej grzbietowa część rdzenia NAc.
- Stymuluj VTA i zapisz amplitudę piku DA.
- Opuść lub podnieś mikroelektrodę z włókna węglowego w miejscu, które powoduje największe uwolnienie DA.
- Upewnij się, że pik odpowiedzi DA jest wyraźnym pikiem utleniania przy 0,6 V i pikiem redukcji przy -0,2 V. Te piki wskazują na DA.
4. Rejestracja FSCV w połączeniu z infuzją i stymulacją
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje harmonogram nagrywania przed i po mikroinfuzji VTA.
- Po zoptymalizowaniu położenia włókna węglowego i elektrody stymulującej/kaniuli prowadzącej, stymuluj przez ~20−30 min.
nuta: Przy obecnych parametrach stymulacji nie należy stymulować częściej niż raz na 3 minuty, aby umożliwić ponowne ładowanie pęcherzyków22.
- Po osiągnięciu stabilnej wartości wyjściowej (<20% odchylenia w ciągu pięciu stymulacji), delikatnie opuść kaniulę wewnętrzną ręcznie do kaniuli prowadzącej, która jest wstępnie zamontowana w stymulatorze bipolarnym.
- Wykonaj dodatkowe 2−3 nagrania linii bazowej, aby upewnić się, że samo wprowadzenie kaniuli nie zmieniło wywołanego sygnału. W niektórych przypadkach wprowadzenie i wyjęcie kaniuli wewnętrznej może spowodować uszkodzenie VTA. Jeśli sygnał zmieni się drastycznie w tym okresie bazowym (>20%), wykonaj dodatkowe 3-4 nagrania, aż linia bazowa ponownie się ustabilizuje.
- Za pomocą pompy strzykawkowej i mikrostrzykawki wlać 0,5 μl roztworu (np. 0,9% soli fizjologicznej, N-metylo-D-asparaginianu [NMDA], kwasu (2R)-amino-5-fosfonowalerinowego [AP5]) do VTA w ciągu 2 minut.
- Po infuzji należy pozostawić kaniulę wewnętrzną na co najmniej 1 minutę przed usunięciem.
nuta: Niektóre leki mogą wymagać pozostawienia kaniuli wewnętrznej na dłuższy czas w oparciu o kinetykę leku, a usunięcie kaniuli wewnętrznej może spowodować, że lek przemieści się z powrotem przez kaniulę wewnętrzną. W razie obaw można pozostawić kaniulę wewnętrzną w kaniuli prowadzącej przez cały czas trwania nagrania. W przeciwnym razie nagrywanie może rozpocząć się po upływie tego 1-minutowego interwału.
- Kontynuuj nagrywanie co 3 minuty, aby zmierzyć efekty po infuzji.
nuta: W przypadku podania roztworu kontrolnego i nie zaobserwowano żadnego efektu, możliwe jest podanie roztworu po raz drugi10. Jeśli występuje zmienione uwalnianie DA spowodowane wprowadzeniem wewnętrznej kaniuli lub wlewu soli fizjologicznej, sygnał zwykle wraca do stanu wyjściowego w ciągu 30 minut.
