Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Uszczelnianie komórek do nagrywania
- Upewnij się, że wszystkie elementy wyposażenia (mikroskop, amplifier, digitizer, mikromanipulator i inne) są włączone przed rozpoczęciem nagrywania.
- Napełnij komorę zapisu, marki handlowej (Tabela materiałów), przymocuj do mikroskopu roztworem aCSF do nagrań. Użyj pompy perfuzyjnej, aby stale perfuzjować aCSF z szybkością 2 ml/min.
- Przenieś interesujący Cię wycinek mózgu (pojedynczo) do komory nagraniowej. Użyj akrylowej pipety transferowej (odwrócona szklana pipeta Pasteura przymocowana do silikonowego smoczka), aby przenieść plastry podwzgórza do komory. Użyj kotwicy plasterka (Tabela materiałów), aby przytrzymać plasterek, aby nie poruszał się podczas perfuzji CSF.
- Umieść plasterek na środku komory rejestracyjnej przymocowanej do mikroskopu. Pozycja warstwy ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić dobry widok żądanego obszaru pod mikroskopem i zapewnić doskonały zasięg mikropipety rejestrującej.
- Użyj soczewki obiektywu mikroskopu immersyjnego o małej mocy (10x lub 20x), aby pomóc w ustawieniu wycinka i zlokalizowaniu obszaru zainteresowania.
- Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania zmień soczewkę obiektywu na soczewkę o dużej mocy (63x) i skup się na poziomie tkanki, obserwując endogenne białko fluorescencyjne i kształty komórek w regionie docelowym, aby zlokalizować komórki kisspeptyny na powierzchni wycinka mózgu.
- Gdy znajduje się możliwa komórka docelowa, zaznacz ją na ekranie komputera kursorem myszy lub rysując format, taki jak kwadrat, nad obszarem zainteresowania. Znacznik ekranowy komputera pomaga wskazać pozycję mikropipety rejestrującej do celi.
- Po ustaleniu dokładnego położenia celi docelowej należy podnieść obiektyw i wprowadzić mikropipetę rejestrującą wypełnioną roztworem wewnętrznym. Umieszczając mikropipetę w uchwycie elektrody, upewnij się, że roztwór wewnętrzny styka się z elektrodą srebrną.
nuta: Do przygotowania, umieszczania i pozycjonowania mikropipet na uchwycie elektrody.
- Przed zanurzeniem mikropipety w roztworze aCSF, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do mikropipety, należy zastosować nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności 1-3 ml połączonej z uchwytem mikropipety za pomocą rurki polietylenowej (≈130 cm dłuższej); nanieść prawie 100-200 μl powietrza.
- Za pomocą mikromanipulatora poprowadź mikropipetę poniżej środka obiektywu. Przesuń przyciski na mikromanipulatorze, aby poprowadzić mikropipetę na osi X-Y-Z w kierunku interesującej Cię komórki.
- Ustaw ostrość tak, aby była widoczna końcówka mikropipety i zbliż ostrość do plasterka, ale nie za blisko. Zmniejsz prędkość mikromanipulatora i powoli opuść mikropipetę do płaszczyzny ostrości. Upewnij się, że końcówka mikropipety nie wnika gwałtownie w plasterek, ale raczej powoli opada, aż dotknie powierzchni komórki/obszaru docelowego.
- Zastosuj lekkie nadciśnienie (≈100 μl) za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności 1-3 ml podłączonej do uchwytu mikropipety, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia ze ścieżki podejścia.
- Skoncentruj się na celi docelowej i powoli przesuwaj mikromanipulator na osi X-Y-Z, aby zbliżyć do niej mikropipetę. Podczas dotykania mikropipety do kuwety można zaobserwować wgłębienie spowodowane ciśnieniem wywieranym przez końcówkę mikropipety (rysunek 2C).
- Po uformowaniu wgłębienia, ze względu na bliskość mikropipety do celi, należy zastosować słabe, krótkie odsysanie przez usta (1-2 s) przez rurkę podłączoną do uchwytu mikropipety, aby wytworzyć uszczelnienie między mikropipetą a celą (uszczelka gigaomowa lub gigapipeta >1 GΩ; Rysunek 2D). Aby utworzyć pieczęć, użyj trybu cęgów napięcia w oprogramowaniu.
- Jeśli uszczelnienie pozostaje stabilne (uszczelnienie gigaomowe powinno być stabilne mechanicznie i bez zakłóceń hałasu, określonych przez obserwację przez około 1 min), należy ustawić napięcie podtrzymania na najbliższym fizjologicznym potencjale spoczynkowym interesującego nas ogniwa. W przypadku neuronów podwzgórza kisspeptyny zaleca się -50 mV.
- Zastosuj krótkie ssanie przez usta (podciśnienie) z mikropipetą uszczelnioną do komórki, aby przerwać błonę plazmatyczną (ryc. 2E). Odpowiednią konfigurację całej komórki uzyskuje się, gdy ssanie odbywa się z wystarczającą siłą, aby pęknięta membrana nie zatkała mikropipety i nie przyciągnęła znacznej części membrany, a nawet komórki.
- Sprawdź używaną instrukcję ustawień systemowych. Użyj oprogramowania (patrz tabela materiałów), aby cyfrowo sprawdzić i obliczyć rezystancję szeregową (SR) oraz pojemność całego ogniwa (WCC).
- W trybie cęgowania napięcia, po zerwaniu błony komórkowej, włącz opcję całego ogniwa i kliknij polecenie Auto odnoszące się do zakładki całe ogniwo. SR i wcc komórki zostaną automatycznie obliczone i natychmiast wyświetlone przez oprogramowanie. Parametry te można również sprawdzić, wykonując test membrany ze wzmacniaczem wymienionym w Tabeli Materiałów.
- Upewnij się, że sprawdziłeś parametry żywotności komórek. W przypadku neuronów kisspeptyny sprawdź, czy pomiary elektrofizjologiczne wynoszą: SR < 25 mΩ, rezystancja wejściowa > 0,3 GΩ i wartość bezwzględna prądu utrzymywania < 30 pA. Średnia wartość WCC neuronów AVPV/PeNKisspeptin lub ARHkisspeptin wynosi ≈ 10-12 pF u myszy z nienaruszonymi gonadami.
- Monitoruj SR i pojemność ogniwa w stanie ustalonym podczas eksperymentów. Upewnij się, że SR nie zmienia się o więcej niż 20% podczas nagrywania i że pojemność membrany jest stabilna.
- Sprawdź ustawienia oprogramowania. Utwórz konkretne protokoły dla nagrań w zależności od rodzaju eksperymentu. Aby zarejestrować potencjał membrany w trybie cęgowym prądowym, za pomocą sprzętu wymienionego w Tabeli materiałów, należy przefiltrować dolnoprzepustowe sygnały elektrofizjologiczne przy 2-4 kHz i przeanalizować wyniki w trybie offline w oprogramowaniu (informacje o oprogramowaniu znajdują się w Tabeli materiałów).
- Po prawidłowym osiągnięciu konfiguracji całego ogniwa zmierz prądy synaptyczne w trybie cęgów napięciowych (rysunek 2G). Rejestruj zmiany spoczynkowego potencjału błonowego (RMP) i indukowane zmiany RMP w trybie cęgów prądowych (rysunek 2H). Zmiany w RMP, takie jak depolaryzacja błony komórkowej, mogą być wywołane przez podanie znanego leku/neuroprzekaźnika do kąpieli (opisanego w kroku 1.2), jak pokazano na rysunku 1.
nuta: W trybie cęgów prądowych można wstrzyknąć prąd dodatni lub ujemny, aby utrzymać napięcie membrany na żądanym poziomie. W przypadku neuronów kisspeptyny zwykle ustawiamy wstrzyknięcie prądu zerowego (I = 0), aby zarejestrować spontaniczną zmianę potencjału błonowego.
