$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Elektrofizjologia in vitro
- Przygotowanie roztworów do przygotowania i rejestracji wycinków rdzenia kręgowego
- Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy
nuta: Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) jest używany w komorze inkubacyjnej interfejsu, w której plastry są przechowywane do momentu rozpoczęcia nagrywania oraz podczas eksperymentów zarówno jako perfuzat, jak i rozcieńczalnik leków. Szczegółowy skład znajduje się w tabeli 1.
- Przygotować płyn CSF zawierający (w mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glukozy, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 i 2,5 CaCl2 poprzez dodanie wymaganych ilości powyższego, z wyłączeniem CaCl2, do 2 l wody destylowanej.
- Pęcherzykować powyższy roztwór karbogenem (95%O2, 5% CO2) przez 5 minut i dodać CaCl2,
nuta: Ten krok zapobiega wytrącaniu się CaCl2, tj. roztwór nie powinien stać się mętny. W celu stosowania leku podczas eksperymentów, należy rozcieńczyć roztwory podstawowe leku w aCSF do pożądanych stężeń końcowych.
2. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy podstawiony sacharozą
UWAGA: Podstawiony sacharozą aCSF jest używany podczas preparacji i cięcia rdzenia kręgowego. Jak wskazuje nazwa, sacharoza jest zastępowana NaCl w celu zmniejszenia pobudzenia neuronów podczas tych procedur przy jednoczesnym zachowaniu osmolarności. Szczegółowy skład znajduje się w tabeli 1.
- Przygotować podstawiony sacharozą aCSF zawierający (w mM) 250 sacharozy, 25 NaHCO3, 10 glukozy, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 i 2,5 CaCl2 poprzez dodanie wymaganych ilości wszystkich powyższych, z wyłączeniem CaCl2, do 300 ml wody destylowanej.
- Bulgotać roztwór z karbogenem przez 5 minut, a następnie dodać CaCl2.
- Przechowywać roztwór w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez około 40 minut lub do momentu, gdy roztwór utworzy zawiesinę. Unikaj zamrażania ciał stałych i używaj w konsystencji zawiesiny.
3. Przygotowanie matrycy mikroelektrod
UWAGA: Powierzchnia styku MEA wymaga wstępnej obróbki, aby uczynić ją hydrofilową.
- Przed eksperymentem należy dobrze napełnić MEA płodową surowicą bydlęcą (FBS) lub surowicą końską (HS) przez 30 minut.
- Wyjmij FBS lub HS i dokładnie spłucz MEA około pięcioma płukaniami wody destylowanej, aż woda destylowana przestanie się pienić. Napełnij studnię CSF, gotowy do użycia.
4. Przygotowanie ostrego odcinka rdzenia kręgowego
- Głęboko znieczulij mysz 100 mg/kg ketaminy (i.p.), a następnie odetnij jej głowę za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych.
- Usuń skórę nad okolicą brzucha, wykonując małe nacięcie w skórze na poziomie bioder. Pociągnij skórę po obu stronach nacięcia rostralnie, aż cała skóra zostanie usunięta, tj. od górnej części klatki piersiowej do górnej części miednicy (zarówno brzusznie, jak i grzbietowo).
- Umieść ciało na lodzie i użyj podejścia brzusznego, aby odsłonić kręgosłup, usuwając wszystkie wnętrzności i przecinając żebra po bocznej stronie mostka.
- Usuń brzuszną klatkę piersiową, obie łopatki (odcięte w przybliżeniu T2) oraz kończyny dolne i miednicę (odcięte mniej więcej w górnej części kości krzyżowej).
- Przenieść kręgosłup i preparat żebrowy do kąpieli rozwarstwiającej zawierającej lodowatą sacharozę aCSF. Przypiąć wszystkie cztery rogi preparatu (powierzchnia brzuszna do góry), umieszczając szpilki przez mięśnie dolnej części pleców i przyczepione górne żebra.
- Usuń wszystkie mięśnie i tkankę łączną pokrywającą brzuszną powierzchnię kręgów za pomocą rongeurs i zidentyfikuj obszar kręgowy nad powiększeniem lędźwiowo-krzyżowym, który leży w przybliżeniu poniżej trzonów kręgów od T12 do L2.
- Usuń trzon kręgu, który jest doogonowy do obszaru powiększenia lędźwiowo-krzyżowego, aby zapewnić dostęp do rdzenia kręgowego, gdy znajduje się w kanale kręgowym.
- Za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych przetnij obustronnie szypułki kręgów, jednocześnie podnosząc i ciągnąc trzon kręgu rostralnie, aby oddzielić brzuszne i grzbietowe aspekty kręgów i odsłonić rdzeń kręgowy.
- Po usunięciu trzonów kręgów w celu odsłonięcia powiększenia odcinka lędźwiowo-krzyżowego, ostrożnie usuń pozostałe korzenie, które zakotwiczają rdzeń kręgowy, za pomocą nożyczek sprężynowych, aż rdzeń będzie swobodnie unosił się.
- Odizoluj rdzeń kręgowy za pomocą nacięć rostralnych i ogonowych znacznie powyżej i poniżej powiększenia odcinka lędźwiowo-krzyżowego, pozwalając docelowemu obszarowi rdzenia "swobodnie unosić się".
nuta: Preferowana orientacja plastra określi, w jaki sposób przewód zostanie następnie zamontowany w celu podziału na sekcje (Rysunek 1).
- W przypadku plastrów poprzecznych podnieś odcinek lędźwiowo-krzyżowy za dołączony korzeń i umieść go na wstępnie przyciętym bloku styropianowym (styropianowym) (1 cm x 1 cm x 1 cm) z płytkim kanałem wyciętym pośrodku. Za pomocą kleju cyjanoakrylowego (patrz Tabela materiałów) przymocuj blok i sznurek do platformy sekcyjnej i umieść je w kąpieli tnącej zawierającej lodowatą sacharozę aCSF (zawiesinę).
nuta: Płytki kanał pomaga zabezpieczyć i zorientować rdzeń kręgowy, z odsłoniętą stroną grzbietową i piersiowym końcem rdzenia na dole bloku.
- W przypadku plastrów strzałkowych połóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego na platformie sekcyjnej, podnieś powiększenie odcinka lędźwiowo-krzyżowego za pomocą dołączonego korzenia i umieść sznurek wzdłuż linii kleju, upewniając się, że jedna powierzchnia boczna znajduje się w kleju, a druga jest skierowana do góry. Umieścić go w kąpieli rozbioru zawierającej lodowatą sacharozę aCSF (zawiesinę).
- W przypadku plastrów poziomych połóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego na platformie do cięcia. Podnieś powiększenie lędźwiowo-krzyżowe za pomocą dołączonego korzenia i umieść powiększenie lędźwiowo-krzyżowe wzdłuż linii kleju, upewniając się, że powierzchnia brzuszna znajduje się w kleju, a powierzchnia grzbietowa jest skierowana do góry. Użyj dołączonych korzeni, aby ustawić sznurek. Umieścić go w kąpieli rozbioru zawierającej lodowatą sacharozę aCSF (zawiesinę).
5. Zapisy z matrycy mikroelektrod
UWAGA: Poniższe kroki szczegółowo opisują, jak korzystać z danych rekordowych z eksperymentów opartych na MEA na przekrojach rdzenia kręgowego. W zależności od eksperymentu można zastosować kilka projektów MEA. Szczegóły projektu MEA stosowanych w tych eksperymentach przedstawiono w Tabeli 2 i na Rysunku 2. Szczegółowe informacje projektowe zostały opublikowane przez Egert i wsp. oraz Thiebaud i wsp. odpowiednio dla płaskich i trójwymiarowych (3D) MEA. Oba typy MEA składają się z 60 elektrod z azotku tytanu, z warstwą izolacyjną z azotku krzemu oraz ścieżkami z azotku tytanu i podkładkami kontaktowymi.
- Konfiguracja eksperymentalna
- Włącz komputer i kartę interfejsu, a następnie uruchom oprogramowanie do nagrywania.
- Załaduj wstępnie zmontowany szablon nagrywania (Rysunek 3A). Nazwij pliki na dany dzień na karcie rejestratora.
- Ciągłe bąbelkowanie aCSF karbogenem (5% CO2, 95% O2) przez czas trwania eksperymentu.
- Włącz system perfuzyjny, który jest kontrolowany przez pompę perystaltyczną. Umieść przewód dolotowy w CSF, a koniec wlotowy w zlewce na odpady. Zagruntować linie perfuzyjne za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego.
- Przygotować 4-AP i wszelkie inne roztwory leków, rozcieńczając zapasy w 50 ml aCSF do wymaganego stężenia końcowego (np. 200 μM dla 4-AP).
- Aktywność 4-aminopirydyny (4-AP)
- Po inkubacji przenieść pojedynczą cząstkę z inkubatora za pomocą pipety Pasteura z dużą końcówką wypełnionej płynem CSF.
- Umieść plasterek w dołku MEA i dodaj dodatkowy aCSF.
- Umieść plasterek nad 60-elektrodową matrycą zapisu za pomocą cienkiego pędzla z krótkim włosiem. Unikaj dotykania elektrod pędzlem lub przeciągania chusteczki po elektrodach, zwłaszcza jeśli używasz tablic 3D.
nuta: W zależności od układu MEA, można to zrobić z pomocą mikroskopu lub bez niego w celu dokładnego pozycjonowania.
- Po umieszczeniu plastra umieść obciążoną siatkę na tkance, aby utrzymać ją na miejscu i zapewnić dobry kontakt z elektrodami MEA.
nuta: Plasterek może wymagać zmiany położenia po umieszczeniu siatki.
- Umieść MEA w czołówce nagrywającej (Rysunek 2A, B).
- Sprawdź położenie tkanki nad elektrodami za pomocą mikroskopu odwróconego (2-krotne powiększenie), aby potwierdzić, że jak najwięcej elektrod znajduje się pod powierzchownym rogiem grzbietowym (SDH). Upewnij się, że co najmniej 2-6 elektrod nie styka się z plasterkiem, ponieważ elektrody te są ważne dla odejmowania szumów i rejestrowania artefaktów podczas analizy (rysunek 2E).
- Włącz kamerę, podłącz ją do urządzenia i zrób zdjęcie referencyjne przekroju względem MEA do wykorzystania podczas analizy.
- Naciśnij Start DAQ (akwizycja danych) w oprogramowaniu do nagrywania i upewnij się, że wszystkie elektrody odbierają wyraźny sygnał.
nuta: Jeśli sygnał jest głośny, odepnij scenę czołową i wyczyść zarówno podkładki stykowe MEA, jak i styki ze złotą sprężyną 70% etanolem (użyj chusteczki laboratoryjnej, aby upewnić się, że podkładki i styki są suche po czyszczeniu). Jeśli sygnał jest nadal zaszumiony, wyłącz nieprawidłowo działające elektrody w oprogramowaniu do nagrywania lub zanotuj w celu wykluczenia później podczas analizy.
- Podłącz przewody wlotowe i wylotowe perfuzji do studzienki MEA (uprzednio wypełnionej CSF) i włącz system perfuzyjny. Sprawdź natężenie przepływu, najlepiej 4-6 objętości kąpieli na minutę, i upewnij się, że odpływ jest wystarczający, aby zapobiec przepełnieniu się superbezpiecznika.
- Pozwól tkance zrównoważyć się przez 5 minut, a następnie zapisz 5 minut surowych, niefiltrowanych danych wyjściowych.
- Przenieś linię wlotową perfuzji z aCSF do roztworu 4-AP i odczekaj 12 minut, aż aktywność rytmiczna wywołana przez 4-AP osiągnie stan ustalony (2 minuty, aby leki dotarły do kąpieli i 10 minut, aby aktywność osiągnęła szczyt, a następnie ustabilizowała się).
- Nagraj 5 minut aktywności wywołanej przez 4-AP. Należy przygotować się na kolejne nagrania w celu przetestowania leków lub sprawdzenia stabilności 4-AP.
Tabela 1: Sztuczne kompozycje płynu mózgowo-rdzeniowego.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
szt.
pkt.
| chemiczny | aCSF (mM) | aCSF (g/100 ml) | Podstawiony sacharozą aCSF (mM) | Sacharoza podstawiona aCSF (g/100 ml) | Wysoka zawartość potasu aCSF (mM) | Wysoka zawartość potasu aCSF (g/100 ml) |
| Chlorek sodu (NaCl) | Rozdział 118 | 0,690 | - | - | Rozdział 118 | 0,690 |
| Wodorowęglan sodu (NaHCO3) | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 |
| glukoza | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 |
| Chlorek potasu (KCl) | Rozdział 2.5 | 0,019 | Rozdział 2.5 | 0,019 | Rozdział 4.5 | 0,034 |
| Diwodorofosforan sodu (NaH2PO4) | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 |
| Kloryd magnezu (MgCl2) | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 |
| Chlorek wapnia (CaCl2) | Rozdział 2.5 | 0,028 | Rozdział 2.5 | 0,028 | Rozdział 2.5 | 0,028 |
| sacharoza | - | - | Z kolei 250 | 8,558 | - | - |
Tabela 2: Układy układów mikroelektrod.
| Układy układów mikroelektrod |
| Model matrycy mikroelektrod | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Planarne lub trójwymiarowe (3D) | Planar | 3d | 3d | Planar |
| Siatka elektrod | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | Wymiary: 6 x 10 |
| Odstępy między elektrodami | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Średnica elektrody | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Wysokość elektrody (3D) | N/a | 40 μm | 50 μm | N/a |
| Eksperymenty | Przekrój poprzeczny | Przekrój poprzeczny | Strzałkowy + Poziomy | Strzałkowy + Poziomy |
