Oparta na mikroelektrodach ocena sieci neuronalnych w wycinkach rdzenia kręgowego myszy

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Elektrofizjologia in vitro

1. Przygotowanie roztworów do przygotowania i rejestracji wycinków rdzenia kręgowego
   1. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy
      nuta: Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) jest używany w komorze inkubacyjnej interfejsu, w której plastry są przechowywane do momentu rozpoczęcia nagrywania oraz podczas eksperymentów zarówno jako perfuzat, jak i rozcieńczalnik leków. Szczegółowy skład znajduje się w tabeli 1.
2. Przygotować płyn CSF zawierający (w mM) 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 10 glukozy, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ i 2,5 CaCl₂ poprzez dodanie wymaganych ilości powyższego, z wyłączeniem CaCl₂, do 2 l wody destylowanej.
3. Pęcherzykować powyższy roztwór karbogenem (95%_O2, 5% CO₂) przez 5 minut i dodać CaCl₂,
   nuta: Ten krok zapobiega wytrącaniu się CaCl₂, tj. roztwór nie powinien stać się mętny. W celu stosowania leku podczas eksperymentów, należy rozcieńczyć roztwory podstawowe leku w aCSF do pożądanych stężeń końcowych.

2. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy podstawiony sacharozą

UWAGA: Podstawiony sacharozą aCSF jest używany podczas preparacji i cięcia rdzenia kręgowego. Jak wskazuje nazwa, sacharoza jest zastępowana NaCl w celu zmniejszenia pobudzenia neuronów podczas tych procedur przy jednoczesnym zachowaniu osmolarności. Szczegółowy skład znajduje się w tabeli 1.

1. Przygotować podstawiony sacharozą aCSF zawierający (w mM) 250 sacharozy, 25 NaHCO₃, 10 glukozy, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ i 2,5 CaCl₂ poprzez dodanie wymaganych ilości wszystkich powyższych, z wyłączeniem CaCl₂, do 300 ml wody destylowanej.
2. Bulgotać roztwór z karbogenem przez 5 minut, a następnie dodać CaCl₂.
3. Przechowywać roztwór w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez około 40 minut lub do momentu, gdy roztwór utworzy zawiesinę. Unikaj zamrażania ciał stałych i używaj w konsystencji zawiesiny.

3. Przygotowanie matrycy mikroelektrod

UWAGA: Powierzchnia styku MEA wymaga wstępnej obróbki, aby uczynić ją hydrofilową.

1. Przed eksperymentem należy dobrze napełnić MEA płodową surowicą bydlęcą (FBS) lub surowicą końską (HS) przez 30 minut.
2. Wyjmij FBS lub HS i dokładnie spłucz MEA około pięcioma płukaniami wody destylowanej, aż woda destylowana przestanie się pienić. Napełnij studnię CSF, gotowy do użycia.

4. Przygotowanie ostrego odcinka rdzenia kręgowego

1. Głęboko znieczulij mysz 100 mg/kg ketaminy (i.p.), a następnie odetnij jej głowę za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych.
2. Usuń skórę nad okolicą brzucha, wykonując małe nacięcie w skórze na poziomie bioder. Pociągnij skórę po obu stronach nacięcia rostralnie, aż cała skóra zostanie usunięta, tj. od górnej części klatki piersiowej do górnej części miednicy (zarówno brzusznie, jak i grzbietowo).
3. Umieść ciało na lodzie i użyj podejścia brzusznego, aby odsłonić kręgosłup, usuwając wszystkie wnętrzności i przecinając żebra po bocznej stronie mostka.
4. Usuń brzuszną klatkę piersiową, obie łopatki (odcięte w przybliżeniu T2) oraz kończyny dolne i miednicę (odcięte mniej więcej w górnej części kości krzyżowej).
5. Przenieść kręgosłup i preparat żebrowy do kąpieli rozwarstwiającej zawierającej lodowatą sacharozę aCSF. Przypiąć wszystkie cztery rogi preparatu (powierzchnia brzuszna do góry), umieszczając szpilki przez mięśnie dolnej części pleców i przyczepione górne żebra.
6. Usuń wszystkie mięśnie i tkankę łączną pokrywającą brzuszną powierzchnię kręgów za pomocą rongeurs i zidentyfikuj obszar kręgowy nad powiększeniem lędźwiowo-krzyżowym, który leży w przybliżeniu poniżej trzonów kręgów od T12 do L2.
7. Usuń trzon kręgu, który jest doogonowy do obszaru powiększenia lędźwiowo-krzyżowego, aby zapewnić dostęp do rdzenia kręgowego, gdy znajduje się w kanale kręgowym.
8. Za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych przetnij obustronnie szypułki kręgów, jednocześnie podnosząc i ciągnąc trzon kręgu rostralnie, aby oddzielić brzuszne i grzbietowe aspekty kręgów i odsłonić rdzeń kręgowy.
9. Po usunięciu trzonów kręgów w celu odsłonięcia powiększenia odcinka lędźwiowo-krzyżowego, ostrożnie usuń pozostałe korzenie, które zakotwiczają rdzeń kręgowy, za pomocą nożyczek sprężynowych, aż rdzeń będzie swobodnie unosił się.
10. Odizoluj rdzeń kręgowy za pomocą nacięć rostralnych i ogonowych znacznie powyżej i poniżej powiększenia odcinka lędźwiowo-krzyżowego, pozwalając docelowemu obszarowi rdzenia "swobodnie unosić się".
    nuta: Preferowana orientacja plastra określi, w jaki sposób przewód zostanie następnie zamontowany w celu podziału na sekcje (Rysunek 1).
11. W przypadku plastrów poprzecznych podnieś odcinek lędźwiowo-krzyżowy za dołączony korzeń i umieść go na wstępnie przyciętym bloku styropianowym (styropianowym) (1 cm x 1 cm x 1 cm) z płytkim kanałem wyciętym pośrodku. Za pomocą kleju cyjanoakrylowego (patrz Tabela materiałów) przymocuj blok i sznurek do platformy sekcyjnej i umieść je w kąpieli tnącej zawierającej lodowatą sacharozę aCSF (zawiesinę).
    nuta: Płytki kanał pomaga zabezpieczyć i zorientować rdzeń kręgowy, z odsłoniętą stroną grzbietową i piersiowym końcem rdzenia na dole bloku.
12. W przypadku plastrów strzałkowych połóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego na platformie sekcyjnej, podnieś powiększenie odcinka lędźwiowo-krzyżowego za pomocą dołączonego korzenia i umieść sznurek wzdłuż linii kleju, upewniając się, że jedna powierzchnia boczna znajduje się w kleju, a druga jest skierowana do góry. Umieścić go w kąpieli rozbioru zawierającej lodowatą sacharozę aCSF (zawiesinę).
13. W przypadku plastrów poziomych połóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego na platformie do cięcia. Podnieś powiększenie lędźwiowo-krzyżowe za pomocą dołączonego korzenia i umieść powiększenie lędźwiowo-krzyżowe wzdłuż linii kleju, upewniając się, że powierzchnia brzuszna znajduje się w kleju, a powierzchnia grzbietowa jest skierowana do góry. Użyj dołączonych korzeni, aby ustawić sznurek. Umieścić go w kąpieli rozbioru zawierającej lodowatą sacharozę aCSF (zawiesinę).

5. Zapisy z matrycy mikroelektrod

UWAGA: Poniższe kroki szczegółowo opisują, jak korzystać z danych rekordowych z eksperymentów opartych na MEA na przekrojach rdzenia kręgowego. W zależności od eksperymentu można zastosować kilka projektów MEA. Szczegóły projektu MEA stosowanych w tych eksperymentach przedstawiono w Tabeli 2 i na Rysunku 2. Szczegółowe informacje projektowe zostały opublikowane przez Egert i wsp. oraz Thiebaud i wsp. odpowiednio dla płaskich i trójwymiarowych (3D) MEA. Oba typy MEA składają się z 60 elektrod z azotku tytanu, z warstwą izolacyjną z azotku krzemu oraz ścieżkami z azotku tytanu i podkładkami kontaktowymi.

1. Konfiguracja eksperymentalna
   1. Włącz komputer i kartę interfejsu, a następnie uruchom oprogramowanie do nagrywania.
   2. Załaduj wstępnie zmontowany szablon nagrywania (Rysunek 3A). Nazwij pliki na dany dzień na karcie rejestratora.
   3. Ciągłe bąbelkowanie aCSF karbogenem (5% CO₂, 95% O₂) przez czas trwania eksperymentu.
   4. Włącz system perfuzyjny, który jest kontrolowany przez pompę perystaltyczną. Umieść przewód dolotowy w CSF, a koniec wlotowy w zlewce na odpady. Zagruntować linie perfuzyjne za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego.
   5. Przygotować 4-AP i wszelkie inne roztwory leków, rozcieńczając zapasy w 50 ml aCSF do wymaganego stężenia końcowego (np. 200 μM dla 4-AP).
2. Aktywność 4-aminopirydyny (4-AP)
   1. Po inkubacji przenieść pojedynczą cząstkę z inkubatora za pomocą pipety Pasteura z dużą końcówką wypełnionej płynem CSF.
   2. Umieść plasterek w dołku MEA i dodaj dodatkowy aCSF.
   3. Umieść plasterek nad 60-elektrodową matrycą zapisu za pomocą cienkiego pędzla z krótkim włosiem. Unikaj dotykania elektrod pędzlem lub przeciągania chusteczki po elektrodach, zwłaszcza jeśli używasz tablic 3D.
      nuta: W zależności od układu MEA, można to zrobić z pomocą mikroskopu lub bez niego w celu dokładnego pozycjonowania.
   4. Po umieszczeniu plastra umieść obciążoną siatkę na tkance, aby utrzymać ją na miejscu i zapewnić dobry kontakt z elektrodami MEA.
      nuta: Plasterek może wymagać zmiany położenia po umieszczeniu siatki.
   5. Umieść MEA w czołówce nagrywającej (Rysunek 2A, B).
   6. Sprawdź położenie tkanki nad elektrodami za pomocą mikroskopu odwróconego (2-krotne powiększenie), aby potwierdzić, że jak najwięcej elektrod znajduje się pod powierzchownym rogiem grzbietowym (SDH). Upewnij się, że co najmniej 2-6 elektrod nie styka się z plasterkiem, ponieważ elektrody te są ważne dla odejmowania szumów i rejestrowania artefaktów podczas analizy (rysunek 2E).
   7. Włącz kamerę, podłącz ją do urządzenia i zrób zdjęcie referencyjne przekroju względem MEA do wykorzystania podczas analizy.
   8. Naciśnij Start DAQ (akwizycja danych) w oprogramowaniu do nagrywania i upewnij się, że wszystkie elektrody odbierają wyraźny sygnał.
      nuta: Jeśli sygnał jest głośny, odepnij scenę czołową i wyczyść zarówno podkładki stykowe MEA, jak i styki ze złotą sprężyną 70% etanolem (użyj chusteczki laboratoryjnej, aby upewnić się, że podkładki i styki są suche po czyszczeniu). Jeśli sygnał jest nadal zaszumiony, wyłącz nieprawidłowo działające elektrody w oprogramowaniu do nagrywania lub zanotuj w celu wykluczenia później podczas analizy.
   9. Podłącz przewody wlotowe i wylotowe perfuzji do studzienki MEA (uprzednio wypełnionej CSF) i włącz system perfuzyjny. Sprawdź natężenie przepływu, najlepiej 4-6 objętości kąpieli na minutę, i upewnij się, że odpływ jest wystarczający, aby zapobiec przepełnieniu się superbezpiecznika.
   10. Pozwól tkance zrównoważyć się przez 5 minut, a następnie zapisz 5 minut surowych, niefiltrowanych danych wyjściowych.
   11. Przenieś linię wlotową perfuzji z aCSF do roztworu 4-AP i odczekaj 12 minut, aż aktywność rytmiczna wywołana przez 4-AP osiągnie stan ustalony (2 minuty, aby leki dotarły do kąpieli i 10 minut, aby aktywność osiągnęła szczyt, a następnie ustabilizowała się).
   12. Nagraj 5 minut aktywności wywołanej przez 4-AP. Należy przygotować się na kolejne nagrania w celu przetestowania leków lub sprawdzenia stabilności 4-AP.

Tabela 1: Sztuczne kompozycje płynu mózgowo-rdzeniowego.

Tabela 2: Układy układów mikroelektrod.

Rysunek 1: Orientacja przekroju rdzenia kręgowego, metody montażu i cięcia. (A) Plastry poprzeczne wymagają styropianowego bloku tnącego z wyciętym w nim rowkiem nośnym. Rdzeń kręgowy opiera się o blok w rowku nośnym, grzbietowa strona rdzenia jest skierowana od bloku. Blok i sznurek są przyklejane do stolika do cięcia za pomocą kleju cyjanoakrylowego. (B) Plastry strzałkowe przygotowuje się, umieszczając cienką linię kleju cyjanoakrylowego na etapie cięcia, a następnie umieszczając rdzeń kręgowy na boku na kleju. (C) Poziome plastry przygotowuje się poprzez umieszczenie cienkiej linii kleju cyjanoakrylowego na etapie cięcia, a następnie umieszczenie rdzenia kręgowego brzuszną stroną do dołu na kleju.

Rysunek 2: Ułożenie tkanki na matrycy mikroelektrod. (A) Obraz przedstawia otwartą scenę główną MEA z MEA umieszczoną na miejscu. (B) Taki sam jak A z zamkniętą sceną główną MEA na czas nagrań i systemem perfuzji tkanek. (C) Ilustracja przedstawia MEA w postaci, w jakiej został dostarczony przez producenta. Pokazane są podkładki kontaktowe, które łączą się ze złotymi sprężynami sceny głównej, oraz kąpiel tkankowa MEA, w której znajduje się roztwór do kąpieli tkanek i plasterek tkanki. Obszar podświetlony czerwonym kwadratem pośrodku to lokalizacja układu elektrod. (D) Schematy przedstawiają dwie konfiguracje elektrod MEA użyte w tym badaniu, z dalszymi szczegółami przedstawionymi w tabeli 2. Elektroda referencyjna jest oznaczona niebieskim trapezem. Lewy układ elektrod MEA przedstawia konfigurację kwadratową 60 elektrod, najczęściej stosowaną w prezentowanych modelach roboczych 60MEA200/30iR-Ti z elektrodami o średnicy 30 μm oddalonymi od siebie o 200 μm lub 200 μm i 100 μm rozstawionymi 3-wymiarowymi MEA (60MEA200/12/50iR-Ti i 60MEA100/12/40iR-Ti) z elektrodami o średnicy 12 μm i wysokości 50 μm lub 40 μm, odpowiednio. Lewy układ elektrod MEA przedstawia prostokątny układ elektrod 6 x 10-60MEA500/30iR-Ti. (E) Obraz w dużym powiększeniu kwadratowego MEA 60MEA100/12/40iR-Ti z poprzecznym przekrojem rdzenia kręgowego ustawionym do nagrywania. Plaster znajduje się w rzędach elektrod 3-8. Górny rząd elektrod, które nie stykają się z żadną tkanką, służy jako elektrody odniesienia. Obszar SDH jest wyświetlany jako półprzezroczyste pasmo. W tym przypadku SDH nakłada się na elektrody w rzędach 4, 5 i 6 oraz kolumnach 2, 3, 4, 5 i 7 MEA. Podziałka = 200 μm. Skróty: MEA = układ mikroelektrod; SDH = powierzchowny róg grzbietowy.

Rysunek 3: Układy narzędzi do rejestracji i analizy danych oraz przykładowe zapisy matrycy mikroelektrod pokazujące przebiegi pozakomórkowego potencjału czynnościowego i potencjału pola lokalnego. (A) Schemat przedstawia wstępnie skonfigurowany szablon zapisu używany do pozyskiwania danych MEA. Połączenie MEA2100 z narzędziem do nagrywania (scena czołowa/wzmacniacz) umożliwia nazwanie i zapisanie danych. Cztery przykładowe ślady surowych danych (po prawej, 5-minutowe epoki) zostały zebrane przez jeden kanał MEA wykazujący aktywność na początku badania, 12 minut po zastosowaniu 4-AP, kolejne 15 minut po ustalonej aktywności 4-AP i po zastosowaniu kąpieli TTX (1 μM). Należy zauważyć, że dodanie 4-AP (druga ścieżka) powoduje wyraźny wzrost szumu tła i aktywności EAP/LFP. Co ważne, aktywność pozostaje względnie stabilna przez co najmniej 15 minut po ustaleniu aktywności indukowanej przez 4-AP (trzeci ślad). Dodanie TTX (1 μM) znosi wszelką aktywność (ślad dolny). (B) Schemat (po lewej) przedstawia konfigurację oprogramowania analizatora do analizy danych. Narzędzie do eksploratora danych surowych służy do importowania nagrań zebranych przez oprogramowanie do nagrywania. Dane te są następnie przepuszczane przez wielokanałowe narzędzie filtrujące, które odejmuje wybrane sygnały elektrod odniesienia od innych elektrod w celu usunięcia szumów tła. Dane przechodzą przez filtr EAP i narzędzia filtra LFP w celu optymalizacji relacji sygnał-szum dla każdego przebiegu. Po wykonaniu tego kroku dane ścieżki EAP są wprowadzane do narzędzia do wykrywania protokołu EAP, w którym ustawiane są progi. Protokoły EAP są wykrywane, a następnie wysyłane do narzędzia analizatora EAP, gdzie opóźnienia każdego zdarzenia są rejestrowane i eksportowane jako plik txt. plik. Identyczny przepływ pracy odbywa się w przypadku danych LFP przy użyciu odpowiedniego zestawu narzędzi LFP. Prawe ścieżki pokazują dane z pojedynczego kanału MEA zawierającego różne przebiegi zewnątrzkomórkowe. Lokalizacja sygnałów EAP i LFP jest wyróżniona w powyższych "rastrach zliczających". Dolne ślady to epoki od górnego nagrania (oznaczone czerwonymi paskami) pokazujące przebiegi w rozszerzonej skali czasowej, w tym różne sygnały LFP (zwróć uwagę na różnorodność występów) i indywidualne zewnątrzkomórkowe EAP (czerwone kółka). Należy zauważyć, że kształt fali i polaryzacja LFP/EAP różnią się w zależności od liczby neuronów wytwarzających te sygnały, ich odległości od elektrody rejestrującej i ich położenia w stosunku do pobliskich elektrod. Skróty: MEA = układ mikroelektrod; EAP = zewnątrzkomórkowy potencjał czynnościowy; LFP = lokalny potencjał pola; 4-AP = 4-aminopirydyna; TTX = tetrodotoksyna.