$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Nagrania z całego patch-clampu
komórkowego
- Przenieść pierwszy wycinek tkanki do komory rejestracyjnej zanurzonej w ciągłym strumieniu roztworu Krebsa. Zamontuj sekcję za pomocą lekkich ciężarów i zanurz obiektyw.
- Zidentyfikuj obszar prążkowia w mikroskopie i poszukaj neuronów GFP-dodatnich (przeprogramowanych). Wybierz neuron, który ma rozległą morfologię i nie jest pokryty wiązkami włókien lub naczyniami krwionośnymi.
- Przygotować pipety ze szkła borokrzemianowego (3–7 MΩ) do łatania i napełnić następującym roztworem wewnątrzkomórkowym (w mM): 122,5 glukonian potasu, 12,5 KCl, 0,2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,3Na3GTP i 8 NaCl, dostosowany do pH 7,3 za pomocą KOH.
- Przymocuj szklaną pipetę do elektrody rejestrującej i zanurz ją w roztworze. Dokładnie sprawdź rezystancję elektrody. Następnie powoli zbliż się pipetą do ogniwa, utrzymując lekki dodatni nacisk na elektrodę, aby uniknąć zatkania końcówki.
ostrożność: Uważaj, aby śledzić swoją komórkę podczas schodzenia do elektrody i nie wybielać fluorescencji w ogniwie (tj. wyłączaj lampę fluorescencyjną, gdy jej nie potrzebujesz).
- Ostrożnie opłucz otaczającą tkankę za pomocą nadciśnienia elektrody i zbliż się do ogniwa z elektrodą. Umieść elektrodę na samej górze ogniwa i opuść, aż elektroda dotknie membrany. Wykonaj uszczelnienie Giga-Ω między elektrodą a błoną komórkową i za pomocą impulsów podciśnienia rozerwij membranę, aby utworzyć łatkę na całe komórki.
ostrożność: Przeprogramowane neurony są wrażliwe. Zachowaj ostrożność podczas łatania i nie wywieraj zbyt dużego podciśnienia podczas docierania do uszczelki Giga-Ω lub otwierania błony komórkowej. Ponadto łatanie na starszych zwierzętach wymaga praktyki i cierpliwości, ponieważ ich tkanka łączna jest grubsza i trudniej jest uwidocznić neurony.
- Sprawdź spoczynkowe potencjały membranowe natychmiast po włamaniu w trybie cęgów prądowych i zapisz je do analizy.
- W cęgach prądowych utrzymuj ogniwo w zakresie od -60 mV do -80 mV i wstrzykuj prądy 500 ms od -20 pA do +90 pA, z przyrostami co 10 pA w celu indukcji potencjałów czynnościowych.