Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie zwierzęcia do obrazowania
- Umieść sterylną gazę, waciki i autoklawowane narzędzia chirurgiczne w obszarze operacyjnym. Włącz sterylizator Micro Bead do sterylizacji międzyoperacyjnej narzędzi chirurgicznych.
- Znieczulić mysz (samiec lub samica, 1,5–2,5 miesiąca, 20–25 g) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie (i.p.) mieszaniny ketaminy (17,2 mg/ml), ksylazyny (0,475 mg/ml) i acepromazyny (0,238 mg/ml) (6 μl/g masy ciała). Poczekaj, aż zostanie osiągnięta odpowiednia głębokość znieczulenia, gdy zwierzę przestanie reagować na bodziec szczypania palca u nogi i nie będzie miało odruchu rogówkowego. Podczas zabiegu należy podać dawkę przypominającą 1/3 pierwotnej dawki koktajlu znieczulającego w razie potrzeby do utrzymania pierwotnego stanu znieczulenia.
- Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie (s.c.; 0,05–0,10 mg/kg) jako środek przeciwbólowy przed zabiegiem chirurgicznym. Nałóż maść ochronną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i powstawaniu zaćmy.
- Umieść transgeniczną mysz GCaMP6s na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii i przykryj ją sterylną obłożeniem chirurgiczną. Ustabilizuj głowę zwierzęcia za pomocą adaptera do trzymania głowy dla myszy.
- Ogol głowę na większości skóry głowy za pomocą żyletki z dwoma krawędziami. Oczyść obszar operacyjny sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie roztworem jodu powidonu.
2. Przygotowanie przewlekłego okna czaszkowego
- Wykonaj prostokątne cięcie skóry głowy (2 mm x 3 mm) nożyczkami po jednej (prawej) stronie czaszki. Odsuń skórę na bok bawełnianym wacikiem, aby utworzyć obszar ekspozycji o średnicy >3 mm (Rysunek 1A). Usuń tkankę łączną przyczepioną do czaszki, delikatnie zeskrobując czaszkę ostrzem mikrochirurgicznym (Ostrze skalpela #10; Rysunek 1C).
- Zaznacz obszar S1, delikatnie rysując okrąg (o średnicy 3 mm, współrzędna środkowa: -1,5 mm od bregmy i 2,5 mm od linii środkowej) na czaszce za pomocą wiertła dentystycznego (ryc. 2B).
- Wykonaj tę samą procedurę na lewej czaszce (ryc. 2B).
- Nałóż cienką warstwę kleju Cyjanoakrylan Super Glue na kość, aby zapewnić bazę do aplikacji cementu dentystycznego.
- Pod mikroskopem preparacyjnym rozcieńczyć okrągły rowek w czaszce wokół obszaru S1 za pomocą szybkoobrotowego mikrowiertła (ryc. 1D). Celem jest stworzenie gładkiej krawędzi do umieszczenia na nim okna optycznego.
- Wielokrotnie nakładaj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF, temperatura pokojowa) na czaszkę okresowo podczas procesu rozrzedzania, aby ułatwić wiercenie i rozproszyć ciepło. Wykonuj wiercenie z przerwami, aby uniknąć przegrzania spowodowanego tarciem. Odessać resztki kości za pomocą domowej linii próżniowej lub pompy próżniowej.
- Po wywierceniu około 2/3 głębokości kości, powoli i ostrożnie rozrzedź pozostałą 1/3 kości, aż okrągły kawałek czaszki (płat kostny) zostanie całkowicie wolny od otaczającej czaszki.
- Powoli i ostrożnie usuń okrągły płat kostny za pomocą pary kleszczy # 5/45 i odsłoń oponę twardą (ryc. 2C; Rysunek 1E).
- Utrzymuj odsłonięty obszar mózgu wilgotny za pomocą ACSF (ryc. 1E). Unikaj uszkodzeń naczyń krwionośnych, ponieważ krwotok zmieni przepływ krwi w mózgu, przyspieszy obrzęk mózgu i poważnie pogorszy jakość obrazowania.
- Wykonaj tę samą procedurę po lewej (przeciwległej) stronie czaszki.
- Do montażu okienka optycznego użyj kleju optycznego, aby skleić i utwardzić między warstwami szkła nakrywkowego pojedynczo. W razie potrzeby ogrzej okienko optyczne (50 °C przez 12 godzin) w inkubatorze, aby wzmocnić wiązanie klejowe. Okienko optyczne składa się z 2 części: górna część zawiera pojedyncze okrągłe szkło nakrywkowe o średnicy 5 mm, a dolna część zawiera 1–3 okrągłe szkła nakrywkowe o średnicy 3 mm (rysunek 2D).
- Przechowuj okienko optyczne w etanolu (70%, obj./obj.) i przed użyciem spłucz je sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Przed montażem okna optycznego należy sprawdzić okienko optyczne pod kątem niedoskonałości, w tym nieprawidłowej ilości kleju optycznego lub niedokładnego wyrównania pod stereoskopem.
- Zamontuj okienko optyczne nad obszarem kraniotomii (ryc. 2D). Górna część okna optycznego spoczywa na czaszce, a dolna część okienka optycznego mieści się w otworze kraniotomicznym i spoczywa na oponie twardej w obecności płynu mózgowo-rdzeniowego (ryc. 2D, E).
- Uszczelnij górną część krawędzi okna optycznego do czaszki za pomocą kleju Cyjanoakrylan Super Glue (Rysunek 2F; Rysunek 1F).
- Gdy klej Cyanoacrylate Super Glue wyschnie, nałóż cement dentystyczny (Dentsply), aby pokryć krawędź szkła. Nałóż cement dentystyczny na wszystkie odsłonięte brzegi czaszki i rany, aby zablokować światło (ryc. 2G-H; Rysunek 1B).
- Wykonaj tę samą procedurę po lewej stronie.
- Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej i wróć do klatki domowej w celu odzyskania zdrowia pod odpowiednim nadzorem. Zapewnij mokrą karmę, aby ułatwić żucie i nawodnienie. W celu zmniejszenia dolegliwości bólowych należy podawać buprenorfinę s.c. (0,05–2,0 mg/kg) co 8–12 godzin po urazie przez 2 dni. Pozwól myszy dojść do siebie przez dodatkowe 7–10 dni przed obrazowaniem.
