Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie przewodów, elektrod i narzędzi do zabiegu chirurgicznego
- Użyj następujących narzędzi mikrochirurgicznych: nożyczki chirurgiczne, mikronożyczki kątowe, kleszczyki do tkanek, para zakrzywionych mikroszczypiec Dumont #7 i #5, uchwyt na mikroigły i zwijacze.
nuta: Jest to ostra procedura, więc narzędzia nie muszą być sterylizowane. Po użyciu wyczyść i przetrzyj końcówki 70% etanolem.
- Namocz rurkę w 70% etanolu, a następnie przepłucz ją sterylnym 0,9% NaCl ze 100 U/ml heparyny przed użyciem. Pozostaw rurkę wypełnioną, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do systemu.
- Wytnij 20-30 cm kawałek rurki z polietylenu (PE)-50, aby wykonać cewnik do pomiaru ciśnienia w ciałach jamistych (ICP). Upewnij się, że rurka jest jak najkrótsza, aby zmniejszyć tłumienie ciśnienia.
- Zegnij sterylną igłę 24G na boki, aż igła złamie się w środku. Połącz kawałek ze skosem do dystalnego końca rurki PE w celu włożenia do podudzia prącia. Włóż drugą połowę do piasty w celu podłączenia do przetwornika ciśnienia. Napełnij system heparynizowaną solą fizjologiczną (100 U/ml).
- Aby wykonać bipolarną elektrodę pokrytą teflonem, przytnij dwa srebrne druty o średnicy 125 μm na równą długość. Użyj kawałka taśmy, aby przymocować przewody do krawędzi stołu i skręć je ze sobą. Następnie przymocuj elektrodę do czarnej płytki.
- Wykonaj małe nacięcie w teflonie i użyj mikro kleszczyków #5, aby zdjąć powłokę teflonową o długości 4-5 mm z końcówek elektrod. Odetnij końcówki skalpelem, aby uzyskać równą długość i utwórz haczyki, zaginając końce wokół krawędzi ostrza skalpela.
- Przyklej elektrodę tak, aby koniec wystawał lekko poza krawędź czarnej płytki z haczykami skierowanymi do góry. Mieszaj klej silikonowy na plastikowej płytce przez 10 s i owiń bąbelek kleju wokół elektrody w odległości 1-2 mm od haczyka.
- Pozostaw do wyschnięcia na około 5 minut przed użyciem (Rysunek 1). Zdejmij teflon z dłuższej części na drugim końcu, aby umożliwić połączenie ze stymulatorem.
nuta: Podczas ponownego wykonywania haczyków na dystalnym końcu, elektroda może być wielokrotnie używana.
2. Przygotowanie zwierzęcia
- Po znieczuleniu zwierzęcia ogol dolną połowę brzucha, szyję i krocze. Wyszoruj zwierzę 70% alkoholem, a następnie trzykrotnie jodowidonem. Umieść szczura na podgrzewanej podkładce chirurgicznej w pozycji leżącej. Nałóż maść do oczu weterynarza i zmień znieczulenie na stożek nosowy z 2,5% izofluranem i 0,8 l/min tlenu jako nośnikiem.
nuta: Dostosuj poziom izofluranu i tlenu, aby osiągnąć akceptowalny poziom znieczulenia.
3. Przygotowanie przedoperacyjne
- Całą procedurę chirurgiczną należy wykonać pod mikroskopem operacyjnym: wystarczy powiększenie od 3,15X do 20X. Używaj rękawiczek i utrzymuj czyste środowisko przez cały czas trwania zabiegu. Umieść szczura na zasłonie.
4. Rozwarstwienie mięśnia kulszowo-jamistego do pomiaru ICP
- Użyj skalpela, prostych nożyczek i zakrzywionych mikrokleszczyków Dumont #7, aby wykonać 1 cm pionowe nacięcie skóry 5 mm w bok od linii środkowej, zaczynając od poziomu podstawy penisa i rozciągając się w dół (ryc. 2A). Użyj patyczka higienicznego i ostrożnie oddziel powięź boczną od moszny (ryc. 2B). Po wypreparowaniu powięzi przymocuj retraktory i badaj palpacyjnie za pomocą swapu z bawełnianą końcówką, aby znaleźć guzowatość kulszową (ryc. 2C).
- Przeprowadź sekcję przez tkankę tłuszczową przyśrodkową tego punktu, aż do uwidocznienia mięśnia kulszowo-jamistego (ryc. 3A). Użyj pary zakrzywionych mikrokleszczyków Dumont #7 i podłużnie oddziel mięsień. Tunica albuginea pojawi się jako jasna biała struktura (ryc. 3B). Za pomocą mikrokleszczyków i mikronożyczek odpowiednio nałóż osłonkę białawą, aby zobaczyć jej przebieg (ryc. 3C).
- Po kalibracji ustawień systemu wprowadź rurkę przez skórę krocza, upewniając się, że biegnie równolegle do podudzia prącia (ryc. 4). Pozostaw linię na miejscu i utrzymuj nacięcie wilgotne solą fizjologiczną.
5. Sekcja CN do stymulacji
- Wykonaj 2 cm niższe, pośrodkowe nacięcie brzucha przez skórę, używając najpierw skalpela, a następnie prostych nożyczek i mikrokleszczy. Wykonaj pasujące nacięcie przez powięź wzdłuż kresy białej i leżącej pod nią tkanki mięśniowej, aby odsłonić pęcherz moczowy i prostatę.
- Użyj zwijaczy, aby uzyskać dobrą ekspozycję. Użyj wacików z bawełnianą końcówką, aby oddzielić prostatę od tkanki tłuszczowej, aby uzyskać wyraźną wizualizację głównego zwoju miednicy (MPG) i nerwu jamistego (CN), biegnących po grzbietowo-bocznej stronie prostaty (ryc. 5).
- Po wizualizacji MPG i CN ostrożnie naciąć powięź leżącą nad nerwem 2-5 mm dystalnie do MPG za pomocą kątowych mikronożyczek (ryc. 6a). Za pomocą mikrokleszczyków #5 rozprowadź tkankę po obu stronach nerwu i pod nim, aby uwolnić część o długości 4 mm (ryc. 6b) i wsuń szew 9-0 pod nerw (ryc. 6c).
- Lekko podnieś nerw za pomocą szwu (ryc. 7a), aby ułatwić umieszczenie zaczepów elektrody bipolarnej wokół nerwu (ryc. 7b). Pozwól asystentowi wymieszać dwuskładnikowy klej silikonowy z końcówką igły insulinowej przez 5 sekund. Osusz nerw i nałóż klej na obszar wokół haczyków i nerwu (ryc. 7c, d). Utrzymuj nerw uniesiony, lekko pociągając za elektrodę przez około 1 minutę, aby klej wyschł.
- Wyjmij zwijacze, z wyjątkiem zwijaczy po prawej stronie, aby uniknąć ciągnięcia lub skręcania elektrody. Zwilż odsłonięte narządy solą fizjologiczną i połóż gazę nasączoną solą fizjologiczną na nacięciu.
6. Kaniulacja ciał jamistych do pomiaru ICP
- Przywróć wizualizację tunica albuginea za pomocą retraktorów. Upewnij się, że nie przyczepiasz retraktorów do mięśnia kulszowo-jamistego, ponieważ spowoduje to zniekształcenie podudzia.
- Przymocuj igłę i przepłucz rurkę heparynizowaną solą fizjologiczną przed wprowadzeniem jej do osłonki białawej. Utrzymuj osłonkę białawą rozciągniętą, używając zakrzywionych mikrokleszczyków Dumont #7 w jednej ręce (niedominujących), trzymając osłonkę białawą i resztę leżącego nad nią mięśnia dystalnie do punktu przyczepu. Trzymaj igłę prostymi mikrokleszkami w drugiej dominującej ręce i wprowadzaj ją równolegle do przebiegu ciała jamistego (ryc. 8).
- Wbić igłę 5-8 mm w ciało jamiste. Przepłucz rurkę i dociśnij crus, aby przetestować linię (Rysunek 9). Upewnij się, że nie ma wycieków. Przymocuj rurkę do stołu za pomocą taśmy, aby zapobiec przypadkowemu pociągnięciu za żyłkę. Zdemontować zwijacze.
7. Stymulacja CN
- Podczas uruchamiania programu rejestrującego (np. Spike 2) należy w sposób ciągły rejestrować ciśnienie wewnątrzjamiste i średnie ciśnienie tętnicze.
- Ustaw następujące parametry na stymulatorze (np. SD9 Grass Instruments, patrz Tabela materiałów) do stymulacji CN: prąd przy 1,5 mA, częstotliwość przy 16 Hz, napięcie przy 3 V i szerokość impulsu przy 5 ms. Zastosuj 50 s stymulacji z minimum 1 minutą odpoczynku między stymulacjami.
nuta: Pierwsze stymulacje zwykle skutkują zmniejszoną odpowiedzią (ryc. 10).
