Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Streszczenie

Źródło: Zhu, M., et al. Przygotowanie ostrych wycinków rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego w neuronach substantia gelatinosa. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiedni przegląd etyczny zwierząt.

1. Przygotowanie roztworów i materiałów

1. Rozwiązania
   1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) (w mM): 117 chlorek sodu (NaCl), 3,6 chlorek potasu (KCl), 1,2 diwodorofosforan sodu dwuwodny (NaH₂PO₄·2H₂O), 2,5 dwuwodny chlorek wapnia (CaCl₂·2H₂O), 1,2 chlorek magnezu sześciowodny (MgCl₂·6H₂O), 25 wodorowęglan sodu (NaHCO₃), 11 D-glukoza, 0,4 kwas askorbinowy, i 2 pirogronian sodu. Patrz tabela 1.
   2. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy na bazie K⁺ (w mM): 130 K-glukonianu, 5 KCl, 10 Na 2-fosfokreatyna, 0,5 glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA), kwas 10 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES), 4-trifosforan magnezu adenozyny (Mg-ATP) i 0,3 trifosforan litu guanozyny (Li-GTP). Patrz tabela 2.
   3. Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór na bazie cezu (Cs⁺) (w mM): 92 sulfonian metanu cezu (CsMeSO₄), 43 chlorek cezu (CsCl), 10 Na 2-fosfokreatyna, 5 tetraetyloamonu (TEA)-Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP i 0,3 Li-GTP. Patrz tabela 3.
      nuta: Wszystkie roztwory należy przygotować przy użyciu wody destylowanej. ACSF i sacharoza-ACSF powinny być karbonogenowane (mieszanina 95%_O2 i 5% CO_{2 )} przed użyciem, aby utrzymać optymalne pH około 7,4, a osmolalność tych dwóch roztworów należy dostosować do 300–310 miliosmoli (mOsm). Ponieważ kwas askorbinowy może wpływać na kanały wapniowe, środek ten należy pominąć, jeśli chce się rejestrować prądy wapniowe. Osmolalność i pH roztworów wewnątrzkomórkowych należy zmierzyć i dostosować odpowiednio do 290–300 mOsm i 7,2–7,3. Zaleca się filtrowanie roztworów wewnątrzkomórkowych za pomocą filtrów 0,2 μm i przechowywanie roztworów w postaci 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Cs⁺ i TEA stosuje się w roztworze wewnątrzkomórkowym na bazie Cs⁺ w celu zablokowania kanału potasowego, co sprzyja wykorzystaniu wzmacniacza do utrzymywania potencjału błony na stałym poziomie 0 mV podczas rejestrowania hamujących prądów postsynaptycznych (IPSC).
2. Instrumentów
   1. W przypadku typowego systemu elektrofizjologicznego należy użyć mikroskopu pionowego wyposażonego w kontrast różnicowy interferencji w podczerwieni (IR-DIC) i obiektyw zanurzeniowy w wodzie o wysokiej rozdzielczości, kamery CCD/CMOS, wzmacniacza patch-clamp, uchwytu do mikropipet oraz mikromanipulatora umożliwiającego precyzyjną regulację pozycji pipety. Stolik XY jest również potrzebny do poruszania mikroskopem.
   2. Zamontuj wszystkie urządzenia na stole wibroizolacyjnym otoczonym klatką Faradaya. Podłącz monitor wideo do kamery wideo, aby obserwować neurony i wizualizować mikropipety.
3. Mikropipety
   1. Wykonaj elektrody rejestrujące z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet. Typowa rezystancja pipety waha się od 3 do 6 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.

2. Nagrania z użyciem clampów krosowych dla całej komórki

1. Aby przeprowadzić zapisy całokomórkowe patch-clamp z neuronów istoty żelowej (SG), w większości przypadków rejestracji należy użyć roztworu wewnątrzkomórkowego opartego na K ⁺, a roztworu na bazie C ⁺ tylko do rejestracji hamujących prądów postsynaptycznych.
2. Delikatnie przesuń plasterek rdzenia kręgowego do komory nagrywania, a następnie utrzymuj go za pomocą platynowego drutu w kształcie litery U, mocno przymocowanego nylonowymi gwintami, aby zapewnić optymalną stabilność cięcia. Równomiernie perfunduj plasterek z bąbelkowym ACSF w temperaturze RT przez system grawitacyjny i ustaw szybkość perfuzji na 2-4 ml / min, aby uzyskać wystarczające natlenienie.
3. Zidentyfikuj obszar SG (półprzezroczyste pasmo) za pomocą soczewki mikroskopu o niskiej rozdzielczości, wybierz zdrowy neuron, używając obiektywu o wysokiej rozdzielczości jako komórki docelowej i dostosuj go do środka ekranu monitora wideo.
4. W razie potrzeby napełnij mikropipetę odpowiednią objętością roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K⁺ lub Cs⁺, włóż mikropipetę do uchwytu elektrody i upewnij się, że roztwór wewnątrzkomórkowy styka się ze srebrnym drutem wewnątrz uchwytu.
5. Ustaw ostrość mikropipety, zanurz ją w ACSF za pomocą mikromanipulatora, a następnie zastosuj łagodne nadciśnienie (~1 psi przy pomiarze manometrem), aby odsunąć mikropipetę od wszelkich zabrudzeń i zanieczyszczeń.
6. Stopniowo przesuwaj mikropipetę w kierunku docelowego neuronu. Zwolnij dodatnie ciśnienie, gdy pipeta zbliży się do neuronu, a na błonie neuronalnej utworzy się bardzo mały wgłębienie, które utworzy gigaseal.
7. Zmień potencjał utrzymywania na -70 mV, który jest zbliżony do fizjologicznego spoczynkowego potencjału błonowego (RMP) komórki. Następnie zastosuj przejściowe i delikatne ssanie do mikropipety, aby rozerwać membranę i stworzyć dobrą konfigurację całych komórek.
   nuta: Po przeniesieniu plastra do komory nagrywającej należy zapewnić stałą perfuzję przez co najmniej 5 minut, aby usunąć zanieczyszczenia z powierzchni plastra. Warto zauważyć, że zdolność do rozróżniania zdrowych i niezdrowych/martwych neuronów ma ogromne znaczenie dla dobrego uszczelnienia i stabilnego zapisu. Niezdrowy/martwy neuron ma spuchnięty lub skurczony wygląd, wraz z widocznym dużym jądrem, podczas gdy zdrowy neuron charakteryzuje się trójwymiarowym (3D) kształtem z jasną i gładką błoną, a jego jądro jest niewidoczne. Aby uzyskać konfigurację całego ogniwa, w razie potrzeby należy krok po kroku kompensować szybką lub wolną pojemność. W temperaturze pokojowej (RT) potencjał złącza cieczy oblicza się na 15,1–15,2 miliwoltów (mV) i 4,3–4,4 mV odpowiednio w roztworach wewnątrzkomórkowych opartych na K⁺ i Cs⁺. W naszych badaniach zarejestrowane dane nie zostały skorygowane o potencjał złącza cieczy.
8. Zapisy wewnętrznych właściwości błony
   1. Rejestruj właściwości wypalania: Przetestuj wzorzec wypalania każdego neuronu w cęgach prądowych za pomocą serii 1 s depolaryzujących impulsów prądu (25–150 pikoamperów (pA) z przyrostem 25 pA) przy RMP. Zmierz próg, amplitudę i połowę szerokości pojedynczego potencjału czynnościowego w trybie offline.

Tabela 1: Przepis na ACSF

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: szt. pkt. pkt.

składnik	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)	g/L
Zawartość NaCl	58,5	Rozdział 117	Godzina 6,84
Kcl	74,5	3.6	0,27
NaH2PO4·2H2O	Rozdział 156	Rozdział 1.2	0,19
CaCl2·2H2O	Rozdział 147	Rozdział 2.5	0,37
MgCl2·6H2O	Rozdział 203	Rozdział 1.2	0,24
NaHCO3	Rozdział 84	25	2.1
D-glukoza	180	11	1,98
kwas askorbinowy	Kategoria 198,11	0,4	0,08
Pirogronian sodu	Rozdział 110	cyfra arabska	0,22

Tabela 2: Przepis na wewnątrzkomórkowe rozwiązanie oparte na K⁺

pkt. szt. pkt. szt. pkt. TGL pkt.

składnik	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)	mg/100 ml
K-glukonian	234,2	130	3044.6
Kcl	74,5	5	Dnia 37,28
Na2-fosfokreatyna	453,38 pkt.	10	453,38 pkt.
EGTA (EGTA)	380,35 pkt.	0,5	Godzina 19.02
HEPESY	238,31	10	238,3
Mg-ATP (Mg-ATP)	507.18	4	202,9
Akumulator Li-GTP	523,18 szt.	0,3	Rozdział 15,7

Tabela 3: Przepis na wewnątrzkomórkowe rozwiązanie oparte na Cs⁺

powiedział: szt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. TGL pkt.

składnik	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)	mg/100 ml
CsMeSO4	Rozdział 228	Rozdział 92	2097,6
CsCl	168,36	Rozdział 43	723,95 pkt.
Na2-fosfokreatyna	453,38 pkt.	10	453,38 pkt.
HERBATA-CL	165,71	5	82,86
EGTA (EGTA)	380,35 pkt.	0,5	Godzina 19.02
HEPESY	238,31	10	238,3
Mg-ATP (Mg-ATP)	507.18	4	202,9
Akumulator Li-GTP	523,18 szt.	0,3	Rozdział 15,7

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zawartość NaCl	Sigma	Zobacz materiał S7653	Służy do przygotowania ACSF i PBS
Kcl	Sigma	Numer katalogowy: 60130	Służy do przygotowania ACSF, sacharozy-ACSF i roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+
NaH2PO4·2H2O	Sigma	Numer katalogowy: 71500	Stosowany do wytwarzania ACSF, sacharozy-ACSF i PBS
CaCl2·2H2O	Sigma	Zobacz materiał C5080	Stosowany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF
MgCl2·6H2O	Sigma	Zobacz materiał M2670	Stosowany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF
NaHCO3	Sigma	Zobacz materiał S5761	Stosowany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF
D-glukoza	Sigma	Kontroler G7021	Służy do przygotowania ACSF
kwas askorbinowy	Sigma	Zobacz materiał P5280	Stosowany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF
Pirogronian sodu	Sigma	A7631	Stosowany do wytwarzania ACSF i sacharozy-ACSF
sacharoza	Sigma	Zobacz materiał S7903	Stosowany do przygotowania sacharozy-ACSF
K-glukonian	Wako	169-11835	Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K+
Na2-fosfokreatyna	Sigma	Zobacz materiał P1937	Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego
EGTA (EGTA)	Sigma	E3889	Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego
HEPESY	Sigma	Zobacz materiał H4034	Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego
Mg-ATP (Mg-ATP)	Sigma	A9187	Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego
Akumulator Li-GTP	Sigma	Kontroler G5884	Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego
CsMeSO4	Sigma	Zobacz materiał C1426	Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie Cs+
CsCl	Sigma	Zobacz materiał C3011	Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie Cs+
HERBATA-CL	Sigma	Zobacz materiał T2265	Służy do przygotowania roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie Cs+
Na2HPO4	Odczynniki chemiczne Hengxing		Służy do przygotowania PBS
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Światowe instrumenty precyzyjne	TW150F-4	1,5 mm średnica zewnętrzna, średnica wewnętrzna 1,12 mm
Ściągacz do mikropipet	Instrument Suttera	Zobacz materiał P-97	Służy do przygotowania mikropipet
Kamera CCD na podczerwień	Dage-MIT	IR-1000 (wersja IR-1000
Wzmacniacz z zaciskiem krosowym	HEKA powiedział:	Zobacz materiał EPC-10
Mikromanipulator	Instrument Suttera	Zobacz materiał MP-285
Stolik X-Y	Burleigh	GIBRALTAR X-Y
Mikroskop pionowy	Olympus	BX51WI
Osmometr	zaawansowany	FISKE 210
Miernik pH	METTLER TOLEDO	FE20

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: (wersja angielska) powiedział: powiedział: )