Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie eksperymentalnego rozwiązania
- Przygotuj roztwór preparacyjny od 1 dnia do 1 tygodnia przed właściwym eksperymentem. Do rozwarstwienia siatkówki należy użyć roztworu buforowego kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) ze względu na jego silną zdolność buforowania w niższych temperaturach16. Wymieszaj wszystkie chemikalia w następujący sposób (w mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glukozy. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Roztwór należy przechowywać w lodówce do 1 tygodnia.
- Roztworem do nagrywania jest podłoże Amesa, które jest sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) przeznaczonym do preparacji siatkówki. W dniu eksperymentu odważyć proszek Amesa (4,4 g na 500 ml roztworu) w probówce. Odważyć również NaHCO3 (0,95 g na 500 ml roztworu) i wymieszać z proszkiem Amesa.
- Przygotować roztwór pipety wewnątrzkomórkowej do zapisów z użyciem zacisku krosowego do dnia eksperymentu. Wymieszaj wszystkie chemikalia w następujący sposób (w mM): 111 K-glukonian, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 glikol etylenowy kwas tetraoctowy (EGTA), 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 ATP-Mg i 1,0 GTP-Na. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH. Przefiltrować roztwór pipety za pomocą konwencjonalnego filtra strzykawkowego. Przygotuj ~500 μl porcji i przechowuj je w zamrażarce lub głębokiej zamrażarce.
2. Przygotowania do Dnia Eksperymentu
- W noc poprzedzającą eksperyment umieść mysz w klatce (C57BL/6J lub podobne tło, 4-8 tygodni, samiec) w ciemnym pomieszczeniu w celu nocnej adaptacji do ciemności.
- Przygotowanie do sekcji:
- Napełnij roztwór preparacyjny (100 - 200 ml) szklaną zlewką, umieść go na lodzie i bąbelkuj tlenem przez co najmniej 10 minut.
- Rozpocznij natlenianie ciemnego pudełka w celu przechowywania preparatu siatkówkowego.
- Przygotuj plastikowe szkiełka nakrywkowe z natłuszczonymi szynami do przygotowania plastrów siatkówki i umieść każde z nich w plastikowym naczyniu o średnicy 35 mm.
- Przymocuj nową żyletkę do rozdrabniacza (krajalnicy do chusteczek).
- Przetnij membranę filtracyjną na dwie połowy. To jest do krojenia siatkówki.
- Ustaw narzędzia preparacyjne i przenieś pipety w pobliżu mikroskopu preparacyjnego. Obszar roboczy musi być dobrze zorganizowany, aby każde narzędzie było łatwo dostępne w ciemności.
- Przygotowanie do nagrań z użyciem zacisków krosowych:
- Rozpuścić proszek Amesa i NaHCO3 w wodzie destylowanej (Ames 4,4 g i NaHCO3 0,95 g/500 ml ddH2O). Bąbelkować pożywkę Amesa zmieszanym tlenem (95%O2 i 5% CO2) przez co najmniej 30 minut, podgrzewając do zarejestrowanego poziomu temperatury (~35 °C). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaHCO3, nadal bulgocząc.
- Rozmrozić roztwór pipety wewnętrznej podczas sekcji. Po rozmrożeniu dodaj 0,01% sulforodaminy B do barwienia wewnątrzkomórkowego.
3. Nagrania z klipu do kropek z siatkówki
- Przygotowanie nagrania:
- Zagruntować rurki perfuzyjne pożywką Amesa. Pozwól, aby wszystkie pęcherzyki przeszły przez niego podczas napełniania rurki.
- Wykonaj pipety rejestrujące z zaciskiem krosowym za pomocą ściągacza. Aby napełnić pipetę roztworem pipety, zanurz ją w tylnej części pipety na 1 minutę, aż końcówka pipety zostanie wypełniona. Następnie napełnij ~1/3 pipety za pomocą napełniacza do mikropipet. Każdą pipetę należy przechowywać w wilgotnym pudełku na pipety.
- Włącz sprzęt do nagrywania z zaciskiem krosowym, w tym komputer, amplifier, kamerę z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD) i mikroskop.
- Wyłącz światło w pokoju. Umieść preparat plastra siatkówki w komorze stolika mikroskopu za pomocą wizjera na podczerwień. Po unieruchomieniu rozpocznij ciągłą perfuzję. Ustawić temperaturę perfuzji na 33 do 37 °C.
- Wyświetl powierzchnię przekroju za pomocą kamery CCD. Skoncentruj się na lokalizacji docelowej, w której znajdują się typy komórek docelowych. Wybierz zdrowo wyglądającą komórkę do nagrywania z zaciskiem krosowym (tj. powinna mieć gładką powierzchnię i dobry kształt komórki).
- Umieść pipetę rejestrującą w uchwycie na pipety. Przesunąć pipetę do preparatu plastrów. Gdy znajdzie się w pobliżu miejsca przygotowania plastra (~2 mm powyżej), znajdź końcówkę pipety za pomocą mikroskopu. Gdy końcówka pipety będzie widoczna pod mikroskopem, przesuń końcówkę w dół w kierunku komórki docelowej.
- Ustaw wzmacniacz. Wyreguluj pipetę na 0 mV/0 pA (zerowanie) i rozpocznij ciągły impuls elektryczny o napięciu ~5 mV przy ~10 Hz. Sprawdź rezystancję pipety; idealna rezystancja wynosi od 5 do 10 MΩ dla większości neuronów siatkówki.
- Zacznij wydmuchiwać od końcówki. Użyj ustnika lub strzykawki, aby wywrzeć nadciśnienie, gdy pipeta zanurza się w roztworze do kąpieli. Ciągle wydmuchuj roztwór wewnętrzny, aż końcówka znajdzie się na powierzchni komórki docelowej.
- Gdy nadciśnienie utworzy małe wgłębienie na powierzchni komórki, lekko przesuń końcówkę i przestań wydmuchiwać. Sprawdź rezystancję pipety, która powinna wzrosnąć. Jeśli stale rośnie, pozostaw go i monitoruj rezystancję, aż osiągnie >1 GΩ (gigaseal). Jeśli opór nie wzrasta spontanicznie, delikatnie zastosuj podciśnienie, aż stanie się gigasealem.
- Po osiągnięciu gigaseal zmień potencjał utrzymywania na -70 mV. Następnie należy stosować okresowe podciśnienie, aby rozerwać membranę wewnątrz końcówki pipety. Po wykonaniu konfiguracji całej kuwety rezystancja pipety może wynosić od 500 MΩ do 1 GΩ, a prąd pojemnościowy jest widoczny. Czasami można zaobserwować spontaniczne prądy postsynaptyczne.
- Zapisz zależność prąd-napięcie (I-V) od -80 do +40 mV. W zależności od typu ogniwa aktywowane są różne typy kanałów bramkowanych napięciem.
- Rejestruj prądy lub napięcia synaptyczne wywołane światłem.
