Implantacja podtwardówkowa miękkiej matrycy elektrokortykograficznej do rejestracji elektrofizjologii kory mózgowej u świnek miniaturowych

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Chirurgiczne wszczepienie matryc do miękkiej elektrokortykografii (ECoG)

1. znieczulenie
   1. Premedykacja: Odizolować samicę świnki miniaturowej Getynga (n = 7) w wieku 2-6 miesięcy (5-8 kg) i pościć przez noc. Wstrzyknąć śródskórnie mieszaninę midazolamu w dawce 0,75 mg/kg, atropiny w dawce 0,25 μg/kg mc. i haldolu w dawce 0,1 mg/kg mc. i poczekać, aż zwierzę zostanie uspokojone. Zważ zwierzę przed kontynuowaniem.
   2. Instalacja przewodu dożylnego (IV):
      1. Umieść zwierzę na stole operacyjnym na poduszce grzewczej. Wywołaj znieczulenie, nakładając maskę na twarz na zwierzę, używając sewofluranu w stężeniu 3%-3,5%.
      2. Umieść przewody do elektrokardiogramu na brzuchu, czujnik saturacji krwi na ogonie i czujnik temperatury w nozdrzu.
      3. Umieść przewód dożylny na żyle usznej i potwierdź dostęp krwi za pomocą strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną. Upewnij się, że oczy są nawilżone za pomocą maści.
   3. Intubacja: Wstrzyknąć bolus atrakurium w dawce 0,5 mg/kg, ketaminę w dawce 1 mg/kg i fentanyl w dawce 1-2 μg/kg. Ułóż zwierzę na plecach w celu intubacji. Włóż rurkę 4.5 mm.
   4. Leki: Po intubacji należy przerwać znieczulenie sewofluranem i zainstalować wlew propofolu w dawce 10 mg/kg/h, fentanylu w dawce 2 μg/kg/h, atrakurium w dawce 0,2-0,5 mg/kg/h i soli fizjologicznej w dawce 4-7 mg/kg/h. Rozpocząć infuzję mannitolu w dawce 1 g/kg/h, aby zmniejszyć obrzęk mózgu podczas zabiegu.
      UWAGA: Można zastosować multimodalny schemat analgezji, jeśli jest to zalecane przez lokalną komisję etyki zwierząt.
2. Aseptyczne przygotowanie pola i skóry: Ogolić całą powierzchnię głowy poza polem operacyjnym. Za pomocą sterylnego wacika dokładnie wyszoruj głowę betadyną. Następnie umieść sterylne serwety na stole instrumentacyjnym i na zwierzęciu, aby odsłonić tylko okno operacyjne. Na koniec ponownie wyszoruj głowę sterylnym wacikiem z użyciem betadyny.
3. Kraniotomia i durotomia
   1. Cięcie skóry: Naciąć skórę nożem skalpela wzdłuż linii środkowej. Oddziel mięsień i okostną (25 mm bocznie od bregmy po obu stronach i 40 mm przed i z tyłu bregmy) od kości za pomocą tarnika i umieść rozsiewacze, aby uzyskać optymalny dostęp do późniejszego wiercenia.
   2. Pomiary i znakowanie: Zidentyfikuj bregmę i lambdę i oznacz je sterylnym pisakiem chirurgicznym (ryc. 1A, B). Za pomocą sterylnej linijki nakreśl kontur płata kostnego wyśrodkowany wokół celu implantacji na obu półkulach. W tym konkretnym przypadku wybrano korę słuchową o współrzędnych od -5 mm do -15 mm od bregma i od -4 mm do -20 mm bocznie. Następnie należy dostosować kraniotomię do wielkości implantu i anatomicznych punktów orientacyjnych, ograniczając rozmiar otworu.
   3. Kraniotomia:
      1. Za pomocą wiertła do kości z okrągłym wiertłem tnącym wywierć kontur kraniotomii, biorąc pod uwagę grubość czaszki. Miejsce wiercenia należy przepłukać roztworem soli, aby uniknąć przegrzania kości.
      2. Ostrożnie wywierć kontur jednorodnie, aż dotrze do opony twardej. Przy pierwszym przebiciu zakończ wiercenie konturu, aż stanie się wystarczająco cienki, aby prawie się przebić. Następnie użyj płaskiej szpatułki (po linii środkowej lub bocznej), aby oderwać płat kostny w jednym kawałku, używając krawędzi kraniotomii jako dźwigni. Jeśli napotkasz zbyt duży opór, kontynuuj przerzedzenie kości.
      3. Umieść kawałek kości w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
      4. Po usunięciu płata kostnego ostrożnie odłup krawędź kraniotomii za pomocą Kerisona, aby uniknąć wcięcia ostrej krawędzi kości w oponę twardą.
      5. W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia na oponie twardej lub kości, należy użyć odpowiednio pianki żelowej lub wosku kostnego. Umieść mokry kompres (standardowa podkładka w sterylnym roztworze soli fizjologicznej) w kraniotomii i powtórz ten krok na drugiej półkuli (ryc. 1B).
   4. Durotomia:
      1. Za pomocą igły z zestawu do szycia 6-0 ostrożnie przekłuj i unieś oponę twardą na przednim lub tylnym końcu kraniotomii w połowie odległości między stroną przyśrodkową a boczną i utwórz początek nacięcia nożem kłującym.
      2. Następnie, za pomocą małej płaskiej szpatułki umieszczonej w przestrzeni podtwardówkowej, działającej jako podstawa tnąca w celu ochrony kory, utwórz przednio-tylną szczelinę w oponie twardej, przesuwając się jednocześnie obydwoma narzędziami. Upewnij się, że szczelina jest nieco większa niż szerokość implantu (Rysunek 1C). Jeśli na tym etapie wystąpi jakiekolwiek krwawienie lub uszkodzenie, przykryj go pianką żelową i poczekaj, aż przestanie się utrzymywać.
         UWAGA: Trajektoria szczeliny powinna być dostosowana, jeśli w oponie twardej obecne są duże naczynia krwionośne, aby uniknąć krwawienia.
4. Implantacji
   1. Wkładanie urządzenia:
      1. Przepłukać implant (ryc. 2A) solą fizjologiczną po obu stronach, aby łatwiej wsunął się w przestrzeń podtwardówkową. Umieść implant nad szczeliną opony twardej i za pomocą małych kleszczy wprowadź poddusznie urządzenie, przesuwając je kolejno po każdej krawędzi.
      2. Ostrożnie przytrzymaj cokół urządzenia i przesuwaj się wraz z implantem, aby nie wytworzyć napięcia utrudniającego wprowadzenie. Gdy krawędź łącznika znajduje się na górze szczeliny, zatrzymaj wkładanie.
   2. Zabezpiecz implant: Aby zabezpieczyć implant na miejscu, umieść tytanowy most na za krawędzią kraniotomii lub w skrzydłach kotwiących i zabezpiecz go jedną lub dwiema tytanowymi za pomocą odpowiedniego śrubokręta (ryc. 1D).
   3. Uziemienie: Ostrożnie usuń 1 cm izolacji przewodów uziemiających i włóż ją zewnątrzoponowo na tylny koniec kraniotomii (lub w dowolnym miejscu zewnątrzoponowym daleko od kory ciała lub dużych naczyń krwionośnych) (drut na rysunku 1E)
   4. Powtórz kroki na przeciwległej półkuli bocznej.
   5. Zamknięcie opony twardej: Ostrożnie zszyj oponę twardą wokół implantu za pomocą szwu resorbowalnego 3-0 i małego uchwytu na igłę. Zbliż dwie krawędzie opony twardej do siebie tak bardzo, jak to możliwe, bez rozrywania cienkiej błony drutem do szycia (ryc. 1D, E).
   6. Umieszczenie płata kostnego: Zamocuj tytanowy most na przedniej i tylnej części każdego płata kostnego za pomocą tytanowej. Należy uważać, aby zaplanować rozmieszczenie mostków Ti w odniesieniu do umieszczenia nóg podnóżka w kolejnych krokach. Przykręć koniec tytanowych mostków do czaszki (Rysunek 1F, G).
5. Umieszczenie cokołu i podstawy
   1. Pozycjonowanie: W tej konfiguracji podnóżek ma sześć nóg z dwoma otworami na każda (Rysunek 2B). Zaplanuj umieszczenie podnóżka na czaszce, aby zoptymalizować położenie (unikaj umieszczania ich na krawędzi kraniotomii lub w mięśniu skroniowym). Pomiń otwory w nogach, jeśli nie można ich wkręcić.
   2. Zabezpieczenie podnóżka: Wkręć tytanowe podnóżka, aż zostaną mocno zamocowane (patrz Rysunek 1H).
   3. Umieszczenie cokołu: Usuń tytanowe mostki nad połączeniowymi i odwróć cokół, aby wylądować na płycie podstawy. Przykręć cokół do podnóżka. Sprawdź, czy cokół jest dobrze osadzony (Rysunek 1I).
6. Szew i zamknięcie
   1. Oczyszczanie rany: Oczyść przestrzeń podskórną z kości lub innych zanieczyszczeń, spłukując je solą fizjologiczną. Odetnij trochę skóry wokół krawędzi cokołu, aby utworzyć okrągłą krawędź podążającą za cylindrem.
   2. Szwy podskórne: Usuń rozpieracze i złóż płaty skóry razem. Wykonaj szwy podskórne za pomocą niewchłanialnego drutu do szwów 4-0, w odległości 3 mm od siebie, używając prostych szwów przerywanych lub prostych szwów ciągłych. Zacznij od cokołu, przesuwając się w jego kierunku po obu stronach nacięcia.
   3. Szwy skórne: Zszyj skórę za pomocą niewchłanialnego drutu do szwów 6-0, ze szwami oddalonymi od siebie o 5 mm. Zacznij od cokołu, przesuwając się w jego kierunku po obu stronach nacięcia. Należy zwrócić uwagę, aby uzyskać dobre przyleganie tkanek między dwoma płatami skóry i w pobliżu krawędzi cokołu, aby uniknąć pustej przestrzeni (ryc. 1J).
   4. Opatrunek na ranę: Ponownie oczyść obszar rany sterylną podkładką i betadyną. Nałóż samoprzylepny, sterylny bandaż na ranę.
7. Przebudzenie: Po wykonaniu wszystkich pomiarów odłącz zwierzę od wszystkich środków znieczulających, ale trzymaj je pod wentylacją. W celu znieczulenia należy nakleić plaster z buprenorfiną (25 mg/h) na 24 godziny. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej pokrytej zasłonami, aby przyspieszyć czas budzenia. Po przywróceniu spontanicznego oddychania należy ekstubować zwierzę i umieścić je pod maską tlenową do czasu odzyskania przytomności (co może zająć od 1 do 4 godzin).
8. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami: Przez 5 dni należy utrzymywać zwierzę pod ścisłym nadzorem. Podawać dawkę cefaleksyny w dawce 75 mg dwa razy dziennie z jedzeniem, oddzielnie od innych zwierząt. Dezynfekcję rany należy przeprowadzać codziennie, nakładając duże ilości betadyny za pomocą nasączonych sterylnych podpasek (najlepiej podczas karmienia).
   nuta: Opieka długoterminowa i zakwaterowanie: Operowane zwierzę jest trzymane w izolacji przez 24 godziny. Jest umieszczany z powrotem w swojej pierwotnej grupie społecznej, jeśli zwierzę jest wystarczająco zdrowe, aby wchodzić w interakcje społeczne ze swoimi rówieśnikami. Należy prowadzić codzienną obserwację cokołu i otworu skórnego, aby śledzić integrację urządzenia na głowie. W razie potrzeby oczyść miejsce wokół cokołu dużą ilością betadyny.

2. Zapis elektrofizjologiczny

1. Spontaniczna aktywność: Podłącz bezprzewodowy system nagrywania przez cokół i rejestruj podstawową aktywność przez 2-3 minuty. Nagrania te posłużą jako kontrola do analizy słuchowych potencjałów wywołanych.
2. Słuchowe potencjały wywołane: Oprócz systemu bezprzewodowego włóż głośniki w zamknięte pole w uszach zwierząt. Odtwarzaj impulsową stymulację akustyczną na różnych częstotliwościach (w zakresie od 200 do 20 000 Hz) przy poziomie ciśnienia akustycznego (SPL) około 70 dB w ciągu 120 powtórzeń. Następnie uśrednij nagrania i wyrównaj je w okresie bodźca do analizy.
3. Sensoryczne potencjały wywołane: Umieść igły w pysku w trzech różnych pozycjach. Wywołaj potencjały sensoryczne, stymulując pysk przez ~30 s za pomocą generatora impulsów o różnych amplitudach, aby uzyskać krzywe rekrutacji.

3. Swobodnie poruszające się nagranie

1. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, która została opisana w sekcji 2, aby zarejestrować sygnały czuwania z mózgu. Podłącz bezprzewodową scenę główną, trzymając zwierzę w ramionach eksperymentatora lub karmiąc zwierzę smakołykami, aby odwrócić jego uwagę. Zapewnij stymulację akustyczną za pomocą zewnętrznych głośników umieszczonych blisko zwierzęcia.

Rycina 1: Minimalnie inwazyjna implantacja miękkiego ECoG do mózgu.(A) Chirurgiczny dostęp do czaszki ze wskazaniem bregma. (B) Obustronna kraniotomia z widoczną oponą twardą. (C) Durotomia szczelinowa na pierwszej półkuli. (D) Podtwardówkowa implantacja miękkiego ECoG i zamknięcie opony twardej. (E) Durotomia szczelinowa na drugiej półkuli. Zespolenie płata kostnego na pierwszej półkuli za pomocą mostów tytanowych. (F) Wszczepienie miękkiego ECoG na drugą półkulę i zamknięcie opony twardej. (G) Unieruchomienie płata kostnego na drugiej półkuli. (H) Umiejscowienie podnóżka na czaszce. (I) Mocowanie cokołu do podnóżka. (J) Zamknięcie skóry wokół podstawy cokołu.

Rysunek 2: Cokół kompatybilny z rezonansem magnetycznym. (A) Przewlekły system połączeń przezskórnych (cokół) kompatybilny z rezonansem magnetycznym w celu uzyskania dostępu do matrycy miękkich elektrod. (B) Cokół z elektrodami zamontowanymi na płycie podstawy w celu zakotwiczenia czaszki. Wstawka: Szczegóły podnóżka.