Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Konfiguracja zapisu elektrofizjologicznego
- Przypnij skórę ucha zewnętrznego myszy (małżowiny usznej) do wyłożonej PDMS podstawy komory nagraniowej za pomocą drobnych szpilek przeciw owadom wokół krawędzi (~ 6-8 na ucho), umieszczając oczyszczone nerwy u podstawy ucha w pobliżu dwóch elektrod ssących - jednej do nagrywania (w celu pobrania nerwu), a drugiej elektrody obojętnej (w celu dostarczenia neutralnego sygnału do wzmacniacza różnicowego).
- W przypadku elektrody rejestrującej ostrożnie dopasuj aperturę i wewnętrzną średnicę otworu do łącznej grubości dwóch nerwów, tak aby pasowały jak najściślej i na jak największą długość.
- Wciągnąć nerwy do elektrody poprzez delikatne odsysanie ze strzykawki o pojemności 2 ml przymocowanej do drugiego końca rurką z gumy silikonowej. Upewnij się, że nerwy są proste, nie są złożone ani podwojone.
- Rozwiń dopasowanie o wysokiej rezystancji elektrycznej / impedancji, używając silniejszego ssania do wciągnięcia tkanki łącznej lub tkanki tłuszczowej w celu utworzenia czopka, który szczelnie uszczelnia otwór wokół nerwu.
- W razie potrzeby napełnij drugą (obojętną) elektrodę solą fizjologiczną przez odsysanie (może być wypełniona przez działanie kapilarne).
- Umieść identyczne przewody nagrywające (srebrne lub platynowe) w wewnętrznym otworze elektrod nagrywających, aby stykały się z solą fizjologiczną a nerwem (nagrywającym) lub zwężonym, wypolerowanym ogniowo końcem (obojętnym) elektrody. Każda elektroda jest lutowana indywidualnie do różnych rdzeni dwużyłowego ekranowanego. Umieścić elektrodę do kąpieli (masę) (osad Ag/AgCl) w kąpieli i uziemić ją do ekranu dwużyłowego podłączonego do elektrod rejestrujących.
- Wprowadź aktywność elektryczną z dwóch elektrod do oddzielnych kanałów wzmacniacza różnicowego, filtruj (pasmo przepuszczane 0,2-2 kHz) i view na ekranie oscyloskopu. Sprawdź, czy poziomy szumów elektrycznych kanału A (nagrywanie) i kanału B (obojętny) wyglądają podobnie. Na tym etapie może nie być możliwe zobaczenie normalnych spontanicznych potencjałów czynnościowych w kanale A, zanim obie elektrody zostaną zrównoważone.
- Wyrównaj wszelkie różnice w szumie tła między elektrodami poprzez zwiększenie impedancji elektrod nagrywających (kanał A) lub obojętnych (kanał B). W tym celu należy zassać otoczkę (tkankę łączną) znajdującą się głębiej w elektrodzie i/lub wywierając większą siłę ssącą na strzykawkę o pojemności 50 ml.
- Po "zbalansowaniu" w ten sposób przełącz się z powrotem na zapis różnicowy (A-B) i poszukaj spontanicznych potencjałów czynnościowych (AP) w śladzie lub podczas głaskania włosów na brzegu małżowiny usznej. Jeśli nie obserwuje się żadnej aktywności (skoków), należy ponownie sprawdzić ścisłe dopasowanie nerwu w elektrodzie rejestrującej i otoczki łącznej w elektrodzie obojętnej – zwykle im ściślejsza (wyższa rezystancja) uszczelka i im bardziej równa impedancja w obu elektrodach, tym lepiej. Przy odrobinie wprawy pozwoli to osiągnąć dobrej jakości (>2:1) stosunek sygnału do szumu.
- Rejestruj elektroneurogram za pomocą interfejsu laboratoryjnego i oprogramowania do elektrofizjologii działającego na komputerze. Wyjście audio impulsowe jest bardzo przydatne i można je osiągnąć, przepuszczając neurogram przez wzmacniacz audio i powiązany głośnik audio. Dostosuj próg tak, aby znajdował się tuż powyżej szumu linii bazowej (identyfikowanego przez brak "syczenia" białego szumu).
- Aby zwiększyć dostęp leku lub fluorescencyjnego barwnika styrylowego do lancetowatych zakończeń, ostrożnie oderwij podskórną warstwę tłuszczową w pobliżu brzegu małżowiny usznej, otwierając okno o wymiarach ~5 mm x 5 mm, odsłaniając skórę właściwą i podstawę mieszków włosowych (ryc. 1A, B).
- Przypnij fałd ~1 mm skóry ucha oczyszczonej z tłuszczu na czołowym brzegu (na poziomie właśnie wytworzonego okienka, jeśli ma to zastosowanie), pozostawiając wyraźną szczelinę wypełnioną solą fizjologiczną między przysuniętymi warstwami skóry. Delikatnie pogłaszcz włoski wystające wzdłuż zagiętej krawędzi szpilką lub uziemionymi cienkimi kleszkami, nie dotykając skóry, aby zlokalizować obszar maksymalnego wyjścia AP na oscyloskopie oraz charakterystyczne "kliknięcia" i "trzaski" w wyjściu audio.
2. Rejestrowanie potencjałów czynnościowych wywołanych bodźcem
- Sondę do stymulacji mechanicznej – polerowane ogniowo szkło z mikroelektrody borokrzemianowej o średnicy 10 cm przymocowane do ceramicznego siłownika piezoelektrycznego – należy ustawić tak, aby ruch był równoległy do fałdu skórnego. Umieść końcówkę około 0,5-1 mm od fałdu skórnego, tak aby dotykała włosów, ale nie skóry. Sprawdź skuteczność stymulacji, powoli przesuwając ręcznie końcówkę sondy, aby odchylić włoski i obserwować/słuchać wybijania.
- Za pomocą oprogramowania można sterować mechaniczną stymulacją 1-3 włosów (np. 3 sekundy przy sinusoidach 5 Hz, co 10 sekund. Przemieszczenie sondy 200-500 μm) i rejestrować reakcje wywołane stymulacją w nerwach.
- Podawaj kilka identycznych ciągów stymulacji mechanicznej w odstępach 10 sekund. Zoptymalizuj pozycję sondy pod kątem powtarzalności, a następnie zmniejsz częstotliwość stymulacji zgodnie z protokołem eksperymentalnym (np. częstotliwość powtarzania kropli z 10 sekund do 30 sekund).
- Użyj oprogramowania do rozróżniania aktywności podobnej do AP, np. za pomocą prostego progu ustawionego na ~2x amplitudę szumów o wysokiej częstotliwości i ~25% największych AP.
- Należy zaliczyć AP przekraczające próg jako "zdarzenia", określając ilościowo częstotliwość i charakterystykę wytwarzanych AP.
3. Nagrywanie Wywoływane bodźcem Wypalanie w połączeniu z N-(3-trietyloamoniopropylo)-4-(4-(dibutyloamino)styrylem) Etykietowanie dibromku pirydyny
- Aby zbadać wpływ barwników styrylowych na wywołane bodźcem wypalanie aferentne i etykietowanie końcowe, dodaj odpowiednie stężenie wybranego barwnika styrylowego do roztworu do kąpieli i kontynuuj zapis elektryczny.
- Po wymaganym czasie ekspozycji (zwykle co najmniej 30 minut) należy przygotować preparat do oglądania mieszków włosowych. Rozłóż płat skóry, usuwając kołki mocujące, i odsłoń oczyszczony obszar skóry, aby odsłonić etykietę końcową.
- Zmyj zewnętrzny barwnik solą fizjologiczną bez barwnika, dokonując 3 całkowitych podmian soli fizjologicznej.
- Inkubować w końcowej zmianie zagazowanej, bezbarwnej soli fizjologicznej przez 10-15 minut, aby umożliwić wypłukanie najbardziej uporczywych zanieczyszczeń barwnikiem z odsłoniętych/zewnętrznych membran.
- Usunąć niezinternalizowany barwnik pozostający na błonach za pomocą środka sekwestrującego (sulfobutylowana beta-cyklodekstryna, 1 mM, 5 min) w soli fizjologicznej.
- Przenieść komorę zapisu na stolik pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego i sprzęgnąć komorę z mechanizmem ruchu stolika/suwaka.
- Oświetlić preparat światłem wzbudzającym odpowiednim dla barwnika styrylowego. Użyj obiektywu mikroskopu fluorescencyjnego 10X lub 25X, aby obserwować znakowanie mieszków włosowych (ryc. 1).
