$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Wypreparuj i przygotuj larwy OUN Drosophila
UWAGA: Metody rozbioru ośrodkowego układu nerwowego larw są wyraźnie zilustrowane przez Hafera i Schedla, ale te wcześniej opublikowane metody zmniejszają długość zstępujących neuronów, które są ważne dla pomiaru częstotliwości skoków. W tym miejscu przedstawiono dodatkową metodę wycinania larwalnego OUN, który utrzymuje długie, nienaruszone neurony zstępujące.
- Przygotowanie soli fizjologicznej.
- Przygotować rozbiór i zapis soli fizjologicznej do następujących ilości w mM: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowy (HEPES); miareczkować pH do 7,25.
- Wypreparuj larwę Drosophila CNS.
- Zidentyfikuj i wyekstrahuj wędrującego Drosophila melanogaster w trzecim stadium z fiolki hodowlanej i umieść w 200 μl soli fizjologicznej (ryc. 1A).
- Chwyć haczyki do ust parą cienkich kleszczy i chwyć brzuch robaka drugą parą kleszczy (ryc. 1B).
nuta: Nie wywieraj zbyt dużego nacisku na brzuch, ponieważ może to spowodować rozerwanie cienkiej warstwy kutykularnej robaka.
- Delikatnie pociągnij haczyki do ust i brzuch w różnych kierunkach, aby oddzielić ogonowy koniec robaka od obszaru głowy i odsłonić wnętrzności robaka (ryc. 1C).
nuta: Ośrodkowy układ nerwowy będzie spleciony z tchawicą i przewodem pokarmowym. Nie odcinaj OUN od żadnej tkanki, aby zapobiec przecięciu zstępujących nerwów obwodowych.
- Usunąć OUN z przewodu pokarmowego i tchawicy za pomocą kleszczy (ryc. 1D).
- W razie potrzeby przerwij barierę krew-mózg, ręcznie przecinając OUN tylnie do płatów mózgowych za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas.
nuta: Należy to zrobić w oparciu o właściwości fizykochemiczne stosowanej substancji chemicznej. Czerwona linia na rysunku 2A to sugerowany punkt przecięcia i przecięty OUN z nienaruszonymi zstępującymi pniami nerwów obwodowych pokazanymi na rysunku 2B. Przecięty OUN jest gotowy do eksperymentów po wykonaniu kroku 1.2.5.
2. Zewnątrzkomórkowy zapis OUN Drosophila.
- Przygotuj CNS do nagrywania.
- Wyciągnąć szklaną elektrodę pipetową z kapilar ze szkła borokrzemianowego do rezystancji 5-15 mΩ.
- Włożyć przecięty OUN do komory woskowej zawierającej 200 μl soli fizjologicznej. Clamp niepowlekaną szpilkę przeciw owadom z zaciskiem krokodylkowym przylutowanym do przewodu uziemiającego i włóż szpilkę do soli fizjologicznej, aby zakończyć obwód.
- Za pomocą mikromanipulatorów skieruj elektrodę na ogonowy koniec przeciętego OUN. Wyeliminuj nagrywanie szumów tła, dostosowując poziom progowy w oprogramowaniu do akwizycji/analizy przed kontaktem z obwodowymi pniami nerwowymi.
- Wciągnąć wszelkie dogodne nerwy obwodowe do elektrody ssącej, wywierając lekki podnacisk na strzykawkę.
nuta: Podstawowa częstotliwość wystrzeliwania jest skorelowana z liczbą neuronów wciągniętych do elektrody, gdzie więcej neuronów często powoduje zwiększoną rezystancję elektrody.
- Rozpocznij zewnątrzkomórkowy zapis aktywności nerwów zstępujących do OUN.
- Rozpocznij nagrywanie w oprogramowaniu do akwizycji danych i monitoruj częstotliwość wypalania linii bazowej. Pozwól, aby szybkość ognia zrównoważyła się przez 5 minut przed zebraniem danych dotyczących podstawowej szybkości ognia.
- Odrzucić preparat i zapis, jeżeli schemat odpalania środka kontrolnego nie jest schematem rozrywania podobnym do pokazanego na rysunku 3A.
nuta: Zmieniony wzorzec odpalania sugeruje nieprawidłową lub niestabilną aktywność centralnego generatora wzorców, co może zmienić funkcję neuronalną.
- Po 5 minutach dodaj 200 μl soli fizjologicznej + nośnik, aby zwiększyć całkowitą objętość komory do 400 μl, aby rozpocząć rejestrację kontrolnej szybkości wypalania.
- Po ustaleniu linii podstawowej (3-5 min) pobrać 200 μl soli fizjologicznej i dodać 200 μl czynnika doświadczalnego rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej.
nuta: Dimetylosulfotlenek (DMSO) jest zalecanym rozpuszczalnikiem dla związków lipofilowych i nie powinien przekraczać 0,1% v/v.
- Stosuj stężenia leku w sposób ciągły (od niskich do wysokich stężeń) i rejestruj każde stężenie przez wybrany okres czasu (określony przez badacza na podstawie właściwości chemicznych leku). Oznacz ten punkt czasowy aplikacji leku w oprogramowaniu do akwizycji/analizy, dołączając komentarz zawierający lek i końcowe stężenie.
nuta: Aktywność wypalania OUN zmniejszy się o około 10-20% po 30-50 minutach od rozwarstwienia, dlatego należy przeprowadzić odpowiednie kontrole bez leczenia, a leczenie farmakologiczne nie powinno przekraczać tego czasu.
