Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie konfiguracji MEA
Uwaga: Rozpocznij 15 minut przed nagraniem.
- Przenieść pozostałą objętość 4AP-ACSF (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy 4-aminopirydyny) do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml.
- Umieścić kolbę Erlenmeyera na półce nad wzmacniaczem MEA (matryce mikroelektrod) i użyć przewodów, aby umożliwić ciągłe podawanie roztworu do strzykawki o pojemności 60 ml. Wyregulować wysokość kolby Erlenmeyera i strzykawki tak, aby umożliwić grawitacyjne podawanie z szybkością 1 ml/min.
nuta: Prawidłowa wysokość zależy od wewnętrznej średnicy rurki (ID). W przypadku rurek o średnicy wewnętrznej 5/32 cala wystarczy 30 cm.
- Rozpocząć bulgotanie 4AP-ACSF w kolbie Erlenmeyera i w strzykawce z mieszaniną 95% O2/5% CO2 .
- Pozwól, aby 4AP-ACSF przepłynął przez rurkę perfuzyjną do zlewki, aż w środku nie będzie powietrza; następnie zatrzymaj przepływ roztworu.
- Podłącz element grzejny u podstawy MEA do termostatu. Umieść suchy chip MEA wewnątrz MEA amplifier i zabezpiecz amplifier głowica. Plastikowa pipeta Pasteura przenosi 4AP-ACSF do wlotu i zewnętrznego zbiornika komory rejestrującej.
- Przymocuj kaniulę grzewczą do uchwytu magnetycznego i umieść jej końcówkę w porcie wlotowym komory nagrywania. Przymocuj uchwyt magnetyczny do paska magnetycznego na MEA amplifier głowica. Podłącz rurkę perfuzyjną do kaniuli. Podłącz kaniulę do termostatu.
nuta: Kaniula grzewcza powinna być pokryta skośnymi rurkami z politetrafluoroetylenu (PTFE), aby dotrzeć do portu wlotowego komory nagrywającej i zminimalizować hałas spowodowany metalowym materiałem. Gdy zbiornik wlotowy jest odpowiednio napełniony 4AP-ACSF, krople spadające z systemu perfuzyjnego nie powinny być widoczne.
- Umieść igłę ssącą w zbiorniku i sprawdź, czy występuje podciśnienie, zanurzając ją w ACSF; sprawdź, czy nie słychać stałego dźwięku ssania o niskiej częstotliwości.
nuta: Igłę ssącą należy umieścić tak, aby 4AP-ACSF przepływał tuż nad powierzchnią wycinka mózgu. Można użyć linii próżniowej lub cichej pompy próżniowej.
- Ustaw regulator przepływu tak, aby zezwolił na natężenie przepływu 1 ml/min i rozpocznij perfusing.
nuta: Perfuzja zasilana grawitacyjnie eliminuje hałas, który może być spowodowany przez pompy perystaltyczne; Jeśli preferowane są pompy perystaltyczne, modele o niskim poziomie hałasu są obowiązkowe.
- Gdy 4AP-ACSF przepłynie przez kaniulę, włącz termostat. Ustaw kaniulę grzewczą na 37 °C, a podstawę MEA na 32 °C, aby osiągnąć temperaturę 32 - 34 °C wewnątrz komory nagrywającej.
UWAGA: UWAGA! Nigdy nie podgrzewaj kaniuli bez znajdującego się w niej roztworu, ponieważ może ona zostać nieodwracalnie uszkodzona. Ustaw temperaturę kaniuli wyższą niż temperatura zapisu (tj. 32 - 34 °C), aby uwzględnić przesunięcie temperatury wewnętrznej między ustawioną wartością a wartością rzeczywistą na końcówce kaniuli grzewczej i w komorze rejestrującej. Natężenie przepływu, temperatura otoczenia i objętość komory zapisu mają wpływ na temperaturę roztworu rejestrującego. Ustawienia zgłoszone w kroku 1.9 są zoptymalizowane pod kątem opisanego protokołu i sprzętu. Zawsze sprawdzaj rzeczywistą temperaturę nagrywania za pomocą termopary i dostosuj ustawienia w razie potrzeby. Nie podgrzewaj podstawy MEA powyżej 34 °C, aby uniknąć przegrzania wycinka mózgu.
- Umieścić zewnętrzną elektrodę odniesienia w zbiorniku wlotowym komory rejestracyjnej.
nuta: Chociaż chipy MEA są wyposażone w wewnętrzną elektrodę referencyjną, niestandardowa komora nagrywająca obejmuje to. W związku z tym należy użyć zewnętrznej elektrody referencyjnej. Nasycone granulki KCl (chlorek potasu) są najbardziej praktyczne, ponieważ są gotowe do użycia bez konieczności chlorowania.
2. Mapowanie na żywo MEA
- Gdy poziom 4AP-ACSF i temperatura nagrywania ustabilizują się zgodnie z potrzebami, przekręć kurki perfuzyjne i ssące do pozycji wyłączonej, aby tymczasowo je zatrzymać.
- Szybko przenieś jeden wycinek mózgu do komory zapisu MEA za pomocą pipety Pasteura z odwróconym szkłem. W razie potrzeby dostosuj jego położenie w obszarze nagrywania MEA za pomocą polerowanej na ogniowo, zwijanej pipety Pasteura (Rysunek 1C) lub miękkiej, kompaktowej szczoteczki. Umieść kotwicę dociskową (Rysunek 1D) na wycinku mózgu. Ponownie uruchom perfuzję i ssanie, przekręcając ich kurki z powrotem do pozycji włączonej.
UWAGA: KRYTYCZNE! Wycinek powinien zostać przeniesiony, a perfuzja wznowiona w ciągu 60 sekund, w przeciwnym razie tkanka może umrzeć. Kotwica dociskowa plastra powinna być przechowywana w 4AP-ACSF, aby zapobiec przesuwaniu się wycinka mózgu podczas umieszczania kotwicy na wycinku mózgu z powodu różnic w napięciu powierzchniowym. Kotwica do mocowania wycinka mózgu na MEA może być wykonana na zamówienie przy użyciu drutu ze stali nierdzewnej i nici nylonowej (rysunek 1D) lub uzyskana ze źródeł komercyjnych. Rysunek 1E pokazuje ostateczną konfigurację eksperymentalną z chipem MEA podłączonym do głowicy wzmacniacza: wycinek mózgu spoczywający na chipie MEA w komorze nagraniowej jest przytrzymywany przez niestandardową kotwicę. Elektroda referencyjna (czerwone kółko) i rurka PTFE pokrywająca kaniulę grzewczą (czerwona strzałka) są umieszczone w zbiorniku wlotowym, natomiast igła ssąca (niebieska strzałka) jest umieszczona w zbiorniku wylotowym.
- Zrób zdjęcie wycinka mózgu za pomocą kamery zamontowanej na stoliku z odwróconym mikroskopem.
- Uruchom skrypt mapMEA w oprogramowaniu komputerowym, aby uruchomić graficzny interfejs użytkownika w celu mapowania elektrod.
nuta: Specjalnie zaprojektowane oprogramowanie pozwala użytkownikowi wybrać elektrody, które odpowiadają określonym strukturom wycinka mózgu. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla aktywacji prawidłowego szlaku i stłumienia aktywności ictal za pomocą stymulacji elektrycznej.
- Kliknij przycisk Przeglądaj, aby załadować obraz wycinka mózgu. Upewnij się, że elektroda referencyjna znajduje się w górnym rzędzie lewej połowy MEA (Rysunek 2A, znak trójkąta). Kliknij przycisk Activate Pointer (Aktywuj wskaźnik), a następnie wybierz górną i dolną elektrodę w skrajnym lewym rzędzie matrycy, aby zaznaczyć współrzędne XY do prostowania obrazu i mapowania elektrod.
- Z menu rozwijanego typu plasterka wybierz opcję Poziomy. Zaznacz pole wyboru Struktury domyślne.
nuta: Możliwe jest dostosowanie struktur poprzez wybranie przycisku Wprowadź nowe struktury. Domyślne struktury poziomego wycinka mózgu przedstawiono na rysunku 2A.
- Korzystając z ponumerowanych przycisków pod obrazem wycinka mózgu, wybierz elektrody odpowiadające zwrotowi z inwestycji i kliknij odpowiedni przycisk w panelu struktur, aby je przypisać (Rysunek 2B); powtórz ten krok dla każdego ROI.
- Naciśnij przycisk Zapisz: oprogramowanie generuje folder wyników o nazwie #EXP_LabelledElectrodes zawierający tabelę przedstawiającą wybrane elektrody i ROI.
3. Rejestracja i elektryczna modulacja aktywności padaczkowej
- Pozwól wycinkowi mózgu ustabilizować się w komorze nagrywającej przez 5 - 10 minut przed nagraniem.
- Włącz jednostkę bodźca co najmniej 10 minut przed protokołem stymulacji, aby umożliwić samokalibrację i stabilizację. Uruchom oprogramowanie sterujące bodźcem i sprawdź, czy stymulator i MEA amplifier są prawidłowo połączone, jak wskazuje zielona dioda LED w głównym panelu oprogramowania sterującego bodźcem.
- Ustaw stymulację w konfiguracji dwubiegunowej. Wybierz pary elektrod stykające się z piramidalną warstwą komórkową CA1 / bliższego subiculum (porównaj 24,25) spośród tych zmapowanych za pomocą mapy skryptu MEA (patrz sekcja 12). Użyj przewodu, aby podłączyć jedną z wybranych elektrod do ujemnej wtyczki stymulatora, a drugą elektrodę do dodatniej wtyczki tego samego kanału stymulatora. Użyj innego przewodu, aby podłączyć masę stymulatora do masy amplifier.
- Uruchom oprogramowanie do nagrywania. Aby uzyskać dane, naciśnij przycisk PLAY w głównym panelu oprogramowania do nagrywania. Zanotować co najmniej 4 zrzuty ictal.
nuta: Częstotliwość próbkowania 2 kHz pozwala na pozyskiwanie potencjałów pola z odpowiednią rozdzielczością przy jednoczesnym zminimalizowaniu zużycia miejsca na dysku twardym. 5-minutowy plik nagrania zajmuje ~80 MB. Wyższe częstotliwości próbkowania mogą być wymagane, np. w celu rejestrowania artefaktów bodźca lub aktywności wielu jednostek. Aby obserwować tylko potencjały pola, użyj filtra dolnoprzepustowego pod napięciem przy 300 Hz, aby odciąć aktywność wielu jednostek.
- Określ intensywność bodźca.
- W oprogramowaniu do sterowania bodźcami użyj panelu głównego, aby zaprojektować kwadratowy dwufazowy dodatnio-ujemny impuls prądowy o czasie trwania 100 μs/fazę.
UWAGA: UWAGA! Stymulacja prądem stałym wymaga zrównoważonego impulsu ładowania, aby uniknąć uszkodzenia sprzętu.
- Uruchom szybki test wejścia/wyjścia (I/O), aby określić najlepszą intensywność bodźca. Dostarczyć impuls stymulacyjny zaprojektowany w kroku 3.5.1 przy częstotliwości 0,2 Hz lub niższej, dodając interwał między impulsami wynoszący 5 s lub dłuższy w odpowiedniej formie oprogramowania sterującego bodźcem. W zakładce amplituda impulsu wprowadź początkową amplitudę impulsu 100 μA/fazę i zwiększaj ją o 50 - 100 μA przy każdej próbie, aż stymulacja będzie w stanie niezawodnie wywołać zdarzenia podobne do międzynapadowych w korze przyhipokampa (sprawdź sygnały wizualizowane przez oprogramowanie rejestrujące).
- Elektryczna modulacja iktogenezy limbicznej
- Zaprogramuj jednostkę bodźca tak, aby dostarczała interesujący Cię protokół stymulacji. Użyj amplitudy bodźca zidentyfikowanej podczas testu I/O.
nuta: Wskaźnik niepowodzeń wywołanych reakcji powinien wynosić ≤20 %.
- Po ustaniu stymulacji sprawdź, czy sieć wraca do stanu sprzed bodźca, rejestrując co najmniej 4 wyładowania ictal (jak w kroku 3.4).
