Zachowania nawigacyjne larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych

Streszczenie

Źródło: Clark, D. A., et al. Śledzenie zachowania larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje badanie zachowania nawigacyjnego larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych (ORN). Transgeniczne larwy Drosophila wykazujące ekspresję światłoczułych kanałów jonowych w ORN są umieszczane na agarozie w obrębie areny behawioralnej. Stymulacja optogenetyczna światłem otwiera kanały, powodując napływ kationów, który wyzwala przekazywanie sygnału do mózgu, a zachowanie nawigacyjne jest rejestrowane.

Protokół

1. Budowanie areny zachowań i przygotowanie sprzętu umożliwiającego stymulację optogenetyczną na arenie zachowań

1. Aby zbudować arenę zachowań pozbawionych światła, skonstruuj pudełko o wymiarach 89 x 61 x 66 cm³ (35" dł. x 24" szer. x 26 "wys.) wykonane z czarnych kolorowych arkuszy akrylowych z pleksi (o grubości 3 mm) (patrz tabela materiałów). Materiały do budowy takiego pudełka powinny być dostępne w lokalnych sklepach ze sprzętem. Umieść to pudełko na blacie stołu w pokoju zachowania (ryc. 1A).
2. Zamontuj monochromatyczną kamerę CCD (USB) 3.0 z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (Charge-coupled Device) wyposażoną w długoprzepustowy filtr podczerwieni (IR) 830 nm i obiektyw 8 mm F1.4 z mocowaniem C (patrz tabela materiałów) na środku sufitu czarnej skrzynki. Umieść dwa paski diod elektroluminescencyjnych (LED) na podczerwieni (patrz tabela materiałów) na blacie stołu, aby oświetlić larwy w ciemnej arenie (rysunek 1A).
3. Aby zbudować platformę LED, zaopatrz się w kwadratową płytę aluminiową o wymiarach 22 cm × 22 cm (najlepiej pomalowaną natryskowo z matowym czarnym wykończeniem, aby wyeliminować wszelkie odbicia). Na środku płytki za pomocą metalowego noża wytnij otwór, który jest wystarczająco duży, aby zmieścił się wokół kamery CCD.
4. Przykryj metalową płytkę czerwonymi taśmami LED (patrz Tabela materiałów). przewody taśmy świetlnej LED szeregowo i wprowadź przewody taśmy do przekaźnika transoptora sterowanego przez mikroprocesor Raspberry Pi 2B (patrz tabela materiałów) (ilustracje 1B i 2).
5. Zainstaluj i skonfiguruj system operacyjny oparty na Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux na procesorze Raspberry Pi przed podłączeniem przekaźnika transoptora do taśm LED. Podłącz zasilacz do zasilania taśm LED i transoptora (Rysunek 2) (patrz Tabela materiałów). Zamontuj platformę LED wokół kamery CCD (Rysunek 1B).
   nuta: System operacyjny Ubuntu Mate v16.04 jest dostępny bezpłatnie. Zestaw prostych poleceń opartych na Pythonie można łatwo dostosować do programowania wzorców bodźców świetlnych LED (patrz plik ze składnią).
6. Zapewnij jednorodne natężenie promieniowania w różnych punktach areny zachowania. Zmierz bezwzględne natężenie promieniowania na powierzchni areny za pomocą spektrometru i określ, że wynosi ono ~1,3 W/^m2 na całej powierzchni areny.
   nuta: Przy tej intensywności nie zaobserwowano istotnych zmian temperatury w trakcie trwania eksperymentów. W innym badaniu zastosowano wyższe natężenie promieniowania ~1,9 W/^m2 i nie zaobserwowano żadnych zmian temperatury w trakcie eksperymentów.

2. Przygotowanie larw Drosophila do analiz behawioralnych

1. Utrzymuj muchy na standardowym pokarmie dla much (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 25 °C, wilgotności względnej 50-60% (RH) i cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności.
2. W celu ekspresji CsChrimson w pojedynczej parze ORN, należy skrzyżować dziewicze samice z linii UAS-IVS-CsChrimson z samcami z linii OrX-Gal4 ("X" odpowiada jednemu z 21 genów receptora zapachu larw (Or), które ulegają unikalnej ekspresji w każdej z 21 par ORN).
   1. Alternatywnie, w celu ekspresji CsChrimson we wszystkich 21 larwalnych ORN, krzyżuj dziewicze samice z linii UAS-IVS-CsChrimson z samcami z linii Orco-Gal4 ("Orco" to koreceptor, który ulega ekspresji we wszystkich 21 ORN).
   2. W tych eksperymentach należy używać linii UAS-IVS-CsChrimson jako elementu sterującego.
      nuta: Wymienione tutaj stada much są dostępne w Bloomington Drosophila Stock Center (patrz Tabela materiałów).
3. Gdy samce i samice much w krzyżówce będą mogły łączyć się w pary i składać jaja przez 48 godzin, przenieś dorosłe osobniki do świeżej fiolki.
   1. Na powierzchnię fiolki z żywnością zawierającą jaja dodać 400 μl mieszaniny zawierającej 400 μM all-trans retinalu (ATR) rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku (DMSO) i 89 mM sacharozy rozpuszczonej w wodzie destylowanej><. nuta: Niewielka ilość sacharozy sprzyja żerowaniu larw roztworu ATR. ATR jest kofaktorem wymaganym do regulacji w górę ekspresji CsChrimson. ATR jest światłoczuły.
   2. Po dodaniu ATR do fiolek z żywnością zawierających jaja, należy inkubować fiolki w ciemności przez dodatkowe 72 godziny
      UWAGA: Chociaż w tym badaniu i w dwóch poprzednich badaniach nie zaobserwowano wpływu karmienia ATR na zachowanie larw, zaleca się kontrolowanie skutków karmienia ATR poprzez poddanie linii testowych tej samej ilości powyższej mieszaniny, która nie zawiera ATR.
4. Wydobyć larwy trzeciego stadium (~120 godzin po złożeniu jaj) z powierzchni pokarmu much, unosząc je na wodzie za pomocą roztworu sacharozy o dużej gęstości (15%). Za pomocą mikropipety P1000 oddzielić larwy unoszące się na powierzchni roztworu sacharozy do szklanej zlewki o pojemności 1000 ml.
5. Przemyj larwy 3–4 razy, za każdym razem wymieniając 800 ml świeżej wody destylowanej w szklanej zlewce. Pozwól larwom odpocząć przez 10 minut przed poddaniem ich testowi behawioralnemu.

3. Test zachowania

1. Utrzymuj stałą temperaturę (w zakresie 22–25 °C) i wilgotność (od 50 do 60% wilgotności względnej) w pomieszczeniu behawioralnym.
2. Przygotować pożywkę dla larw, wlewając 150 ml stopionej agarozy (1,5%) do kwadratowej szalki Petriego o wymiarach 22 cm x 22 cm. Do każdej próby testu wlewa się jedną szalkę Petriego, 8-10 prób na eksperyment. Pozwól agarozie zestalić się i ostygnąć przez 1-2 godziny na szalkach Petriego przed użyciem ich w teście zachowania.​
   1. Przenieść nie więcej niż 20 przygotowanych larw trzeciego stadium do środka szalki Petriego (ryc. 1C). Przykryj szalkę Petriego pokrywką. Umieść szalkę Petriego na arenie zachowania pod kamerą CCD.
      nuta: W zależności od eksperymentu, testy behawioralne są zwykle przeprowadzane przez 3–5 minut. Jeśli w teście stosuje się środek nawaniający, aby zapewnić wskazówki prowadzące, zaobserwowano, że powstały gradient zapachu pozostaje stabilny przez około 5 minut. Dłuższe czasy oznaczania nie są zalecane. W tych punktach czasowych nie zaobserwowano szkodliwego wpływu na larwy spowodowanego odwodnieniem lub długotrwałą ekspozycją na światło czerwone o długości fali 630 nm.
3. Włącz źródło światła LED na podczerwień 850 nm, aby wyświetlić larwy na filmie. Uruchom kamerę CCD, aby zarejestrować ruch larw.
4. Korzystając z oprogramowania powiązanego z procesorem Raspberry Pi, zaprogramuj procedurę podawania odpowiednich wzorców stymulacji światłem czerwonym.
   nuta: Zestaw prostych poleceń opartych na Pythonie można łatwo dostosować do programowania wzorców bodźców świetlnych LED (patrz plik ze składnią).

Wyniki

Rycina 1: Arena zachowania i podłoże pełzające larw. (A) Widok z przodu na arenę zachowań czarnej skrzynki. Otwarte drzwi areny odsłaniają kamerę CCD zawieszoną pod sufitem loży. (B) Widok z dołu metalowej platformy zawierającej czerwone paski świetlne LED używane do stymulacji optogenetycznej jest zamontowany wokół kamery CCD. (C) Widok z góry na podłoże pełzające ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera wideo do rejestrowania ruchu larw
Kamera CCD	Edmund Optyka	106215
Adapter gwintu filtra M52 do M55	Edmund Optyka	59-446
2-calowy uchwyt filtra z gwintem kwadratowym do soczewek obrazowych	Edmund Optyka	59-445
RG-715, 2" kwadratowy filtr długoprzepustowy	Edmund Optyka	Numer katalogowy: 46-066
Elektronika do konfiguracji optogenetycznej
Raspberry Pi 2B	RASPBERRY-PI.org	RPI2-MODB-V1.2
3-kanałowy programowalny zasilacz	newegg.com	9SIA3C62037092
8-kanałowy przekaźnik transoptora	amazon.com	6454319
630nm Czterorzędowe taśmy LED	environmentallights.com	czerwony3528-450-szpula
Taśmy LED 850nm	environmentallights.com	wp-4000K-CC5050-60x2-zestaw
oprogramowanie
Ubuntu MATE w wersji 16.04	Nubuntu	https://github.com/yslo/nubuntu
Pozostałe punkty
Pleksi akryl	Magazyn domowy	MC1184848BL
Pokarm dla much i inne odczynniki
Pokarm dla much Nutrifly	Genesee Scientific	66-112
Agaroza w proszku	Genesee Scientific	20-102
Kwadratowa szalka Petriego 22 cm X 22 cm	VWR Inc.	25382-327
Dmso	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D2650
sacharoza	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 84097
Wszystkie trans-siatkówkowe	Sigma-Aldrich	Czynnik R2500
Leci
UAS-IVS-CsChrimson	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	Numer katalogowy: 55134
Orko-Gal4	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	Numer katalogowy: 26818
Or42a-Gal4	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	Numer katalogowy 9970
Or7a-Gal4	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	Numer katalogowy 23907

Rozdział TGL TGL powiedział: Rozdział SZT. powiedział: powiedział: powiedział: