Hamowanie pobudzających prądów postsynaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w mysich wycinkach hipokampa

Streszczenie

Źródło: Thalhammer, A., et al. Łączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje hamowanie pobudzających prądów synaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w wycinkach mózgu myszy w hipokampie. Neurony CA3 zostały zainfekowane rekombinowanym wektorem wirusowym zawierającym konstrukt do ekspresji fluorescencyjnego reportera, aktywowany światłem kanał błonowy i mikroRNA, który obniża ekspresję kanałów wapniowych bramkowanych napięciem. Po umieszczeniu wycinka w komorze rejestracyjnej i załataniu neuronu CA1 za pomocą pipety rejestrującej, impulsy świetlne zostały wykorzystane do stymulacji kanału aktywowanego światłem, co spowodowało napływ jonów i wygenerowanie potencjału czynnościowego. Brak kanałów wapniowych bramkowanych napięciem w neuronach CA3 hamuje uwalnianie neuroprzekaźników, powodując hamowanie pobudzających prądów postsynaptycznych w synaptycznych neuronach CA1.

Protokół

1. Ocena roli białek presynaptycznych w nienaruszonych obwodach neuronalnych poprzez celowaną stymulację uszkodzonych neuronów za pomocą optogenetyki

UWAGA: Poniższy protokół wymaga wcześniejszego doświadczenia z zapisami elektrofizjologicznymi w ostrych wycinkach mózgu i dostępu do konfiguracji elektrofizjologicznej.

1. Stereotaktycznie wstrzyknąć rekombinowany wirus związany z adenotypem z mozaikowym serotypem 1 i 2 (rAAV1/2) do mózgu. Określ współrzędne stereotaktyczne dla obszaru mózgu zainteresowania za pomocą atlasów stereotaktycznych dla mózgu myszy lub szczura.
   1. Za pomocą ściągacza do mikropipet wyciągnąć mikropipety iniekcyjne z długimi trzpieniami Ø 7–9 μm; przypiąć mikropipety iniekcyjne do trzonków nożyczkami. Za pomocą cienkiego markera i papieru milimetrowego umieść znaczniki kalibracji na mikropipetach iniekcyjnych co 2 mm.
   2. Znieczulić zwierzę izofluranem i utrwalić go w aparacie stereotaktycznym.
   3. Utrzymuj zwierzę w cieple przez cały czas trwania operacji za pomocą poduszki grzewczej ustawionej na 37 °C.
   4. Chroń oczy lubrykantem do oczu.
   5. Ogol futro na głowie elektryczną maszynką do golenia.
   6. Rozprowadź jod powidonu na ogolonej głowie za pomocą wacika.
   7. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj nacięcie w linii środkowej.
   8. Oczyść powierzchnię czaszki wacikiem, aby bregma i lambda były widoczne.
   9. Umieścić mikropipetę iniekcyjną w uchwycie. Przymocuj uchwyt do ramienia stereotaktycznego
   .
   10. Określić współrzędne x i y miejsca iniekcji względem bregmy i/lub lambdy.
   11. Użyj wiertła, aby przerzedzić czaszkę nad obszarem docelowym.
       nuta: Używaj delikatnych ruchów okrężnych i unikaj wiercenia w czaszce, ponieważ spowoduje to uszkodzenie powierzchni mózgu.
   12. Jeśli wystąpi krwawienie, wchłoń nadmiar krwi ręcznikiem papierowym.
       nuta: Nadmiar krwi utrudni prawidłowe określenie współrzędnej z.
   13. Załadować ≤2 μl wirusa do mikropipety iniekcyjnej metodą kapilarną.
   14. Doprowadzić mikropipetę do wstrzykiwań do współrzędnych x i y miejsca wstrzyknięcia.
   15. Oblicz współrzędną z opony twardej i powoli opuść pipetę do mózgu.
   16. Po osiągnięciu współrzędnej z odczekaj 3 minuty, aby umożliwić regulację tkanki.
   17. Zastosować niskie nadciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml połączonej elastyczną rurką z tyłu mikropipety iniekcyjnej. Monitoruj wzrokowo szybkość wyrzucania wirusa z mikropipety iniekcyjnej przez mikroskop preparacyjny i używając znaczników kalibracyjnych jako punktów odniesienia.
       nuta: Wirus należy wstrzykiwać z małą szybkością (<100 nL/min), aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
   18. Po zakończeniu iniekcji należy odczekać 5 minut, wycofać mikropipetę iniekcyjne o 0,2 mm, odczekać kolejne 5 minut, aby uniknąć cofania się wirusa.
   19. Powoli i całkowicie wyjąć mikropipetę do wstrzykiwań z mózgu i przelać ją do pojemnika wypełnionego wybielaczem.
   20. Zwilż czaszkę roztworem fizjologicznym i zszyj skórę 3-4 szwami.
   21. Nałóż maść gentamycyny na ranę.
   Zwierzę należy trzymać
   22. pojedynczo w czystej klatce z granulkami pokarmu i pod lampą grzewczą, aż w pełni wyzdrowieje.
2. ≥15 dni po wstrzyknięciu odetnij głowy zwierzętom w głębokim znieczuleniu izofluranem.
3. Przygotować ostre wycinki mózgu w obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania za pomocą wibratomu przy użyciu zagazowanego (95% O₂, 5% CO₂ ) lodowatego roztworu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF), zawierającego (w mM): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH₂PO₄, 1 MgCl₂, 1 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 2 pirogronian sodu i 18 glukozy (osmolarność dostosowana do 300 mOsm). Na przykład, jeśli celem jest analiza transmisji synaptycznej z neuronów piramidowych CA3 do CA1, przygotuj strzałkowe plastry formacji hipokampa (o grubości 350 μm).
   nuta: Od tego kroku pracuj w warunkach słabego oświetlenia, aby uniknąć aktywacji sondy optogenetycznej przez światło otoczenia.
4. Pozostawić plastry do odzysku przez 30 minut w temperaturze 37 °C w tym samym płynie mózgowym w komorze przeznaczonej do przechowywania plastrów mózgu. Przechowuj plastry w tej samej komorze na wycinki mózgu w temperaturze pokojowej do momentu nagrania.
   nuta: W tych warunkach plastry mogą być utrzymywane w zdrowiu do 6–8 godzin.
5. Przenieść jedną cząstkę do zanurzonej komory zapisowej i połączyć ją z 2 ml/min tego samego aCSF, który został użyty do odzysku, uzupełnionego 1,5 mM CaCl₂ (łącznie Ca²⁺: 2,5 mM) i bez pirogronianu sodu.
   nuta: Plastry są przygotowywane i utrzymywane w niskim stężeniu Ca²⁺ (1 mM) w celu zminimalizowania toksyczności. Nagrania są wykonywane w 2,5 mM Ca²⁺, aby sprzyjać uwalnianiu pęcherzyków.
6. Sprawdzić pokrótce sygnał wyrażonego reportera fluorescencyjnego (np. TdTomato; Rycina 1B) w celu ustalenia lokalizacji i intensywności infekcji.
7. Napełnij elektrodę łatową roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym (w mM): 110 K-glukonian, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA), 3 MgCl₂, sól magnezowa 4-adenozyno-5′-trifosforanu (Mg-ATP), 0,5 sól trisodowa 5'-trifosforanu guanozyny (Na_3-GTP), 20_K2-fosforan kreatyny, bufor kwasu 10 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego skorygowany za pomocą KOH (HEPES-KOH, pH 7,28, 290 mΩ).
   nuta: Użyć elektrody krosowej o rezystancji pipety 5–6 mΩ.
8. W świetle podczerwonym osiągnij szczelną konfigurację całych komórek z neuronu odbierającego sygnały synaptyczne z zainfekowanych neuronów. Na przykład, jeśli neurony piramidowe CA3 zostały zainfekowane, załataj neurony piramidowe w przewodzie proksymalnym do przyśrodkowym regionu CA1 (ryc. 1C).
   nuta: Rezystancja szeregowa może pozostać nieskompensowana, ale powinna być stała i niska (≤20 MΩ).
9. Użyj farmakologii, aby wyizolować badane prądy synaptyczne. Na przykład, jeśli celem jest zbadanie pobudzającej transmisji synaptycznej, zablokuj hamującą transmisję synaptyczną za pomocą 10 μM bicukuliny.
10. Wywoływanie prądów synaptycznych, na przykład pobudzających prądów postsynaptycznych (EPSC), za pomocą niebieskiego lasera o długości fali 473 nm sprzężonego ze światłowodem (Ø ≤250 μm) umieszczonym na somatach zakażonych neuronów (np. CA3 neurony piramidowe).
    1. Dostosuj długość stymulacji do minimum, aby zmniejszyć możliwość wywołania więcej niż jednego potencjału czynnościowego na impuls świetlny. Jeśli używasz ChETA, ustaw go na 2 ms.
    2. Dostosuj siłę stymulacji lasera, aby uzyskać małe, ale wyraźnie wykrywalne prądy synaptyczne (amplituda szczytowa ≤50 pA dla EPSC zarejestrowanych przy potencjale utrzymywania -70 mV między neuronami piramidowymi CA3 i CA1; Rysunek 1D). W przypadku korzystania z ChETA i światłowodu o średnicy 250 μm, siła stymulacji 1–3 mW na wyjściu światłowodu powinna być odpowiednia.
       UWAGA: jeśli nie można regulować siły lasera, użyj filtrów o neutralnej gęstości.
    3. Skieruj światło lasera o długości fali 473 nm na somaty zainfekowanych neuronów, ale nie na ich aksony. Na przykład, świec światłem na somaty CA3 i z dala od pobocznych Schaffera, aby uniknąć bezpośredniej depolaryzacji aksonów.
    4. Nałóż tetrodotoksynę (TTX; 0,5 μM), bloker kanałów sodowych, na próbkę, aby potwierdzić, że kanały są sterowane potencjałem czynnościowym.
    5. W różnych nagraniach zastosuj selektywny bloker do badanego prądu synaptycznego, aby potwierdzić, że stymulacja jest selektywna.
       nuta: Na przykład zastosować 2,3-diokso-6-nitro-7-sulfamoilo-benzo[f]chinoksalinę (NBQX, 10 μM) do EPSC za pośrednictwem receptora glutaminianu kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego (AMPA).
    6. Porównaj optycznie i elektrycznie wywołane prądy synaptyczne w tym samym ostrym wycinku mózgu w odpowiedzi na powtarzającą się stymulację (≥2 bodźce przy ≤20 Hz). Podobny stopień ułatwienia synaptycznego lub depresji należy zaobserwować między stymulacją elektryczną i optyczną przy użyciu kontrolnego mikroRNA (miR), co sugeruje, że podobne mechanizmy komórkowe są aktywowane przez te dwa rodzaje stymulacji.
       nuta: Powyższe kroki są konieczne, aby upewnić się, że stymulacja optyczna nie indukuje bezpośredniej depolaryzacji butonów presynaptycznych, omijając w ten sposób niektóre mechanizmy transmisji synaptycznej.

Wyniki

Rysunek 1. Ocena roli Ca_v2.1 [EFa] i Ca_v2.1 [EFb] w natywnym hipokampie poprzez ukierunkowaną stymulację powalonych neuronów za pomocą optogenetyki. (A) Schemat kasety ekspresyjnej konstruktów rAAV stosowanych w zakażeniu in vivo. (B) Przekrój hipokampa wykazujący, że fluorescencja TdTomato jest ograniczona do regionu CA3 i jego wypływ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plastry mózgu Komora wstępna	Aparatura Harvarda	BSC-PC
Imager oparty na kamerze CCD	Bio-Rad	ChemiDoc™ MP
Odczynniki do hodowli komórkowych	Technologie życiowe
wiertarka	Przodek	Zobacz materiał K.1030
EGTA (EGTA)	Sigma	E4378
Maść gentamycyna	Lokalna apteka
glukoza	Sigma	Kontroler G7021
HEPESY	Sigma	Numer katalogowy: 54459
Mikropipety iniekcyjne	Narishige powiedział:	GD1
Sole nieorganiczne i detergenty	Sigma
Fosforan 2-kreatyny K	Calbiochem (Elektrownia Jądrowa)	237911
KGlukonat	Przywra	Numer katalogowy: 60245
laser	Technologie Laserglow	LRS-0473-GFM-00100-03
błona	Amersham	Protran™ 0,2 μm NC
MgATP (MgATP)	Sigma	A9187
Uchwyt na mikropipety	Narishige powiedział:	IM-H1
Ściągacz do mikropipet	Narishige powiedział:	Komputer PC-100
Na3GTP	Sigma	Telefon komórkowy G8877
NaPyrogronian	Sigma	Zobacz materiał P5280
Smar do oczu	Lokalna apteka	Lacrigel (Łac)
Jod powidonu	Lokalna apteka	Betadine (Betadyna)
Aparatura stereotaktyczna	Wskaźnik WPI
Tetrodotoksyna	Tocris powiedział:	Numer katalogowy 1069	toksyczny
Wibratomizm	Księga Leica	VT1200S