Pomiar aktywności neuronalnej w wycinku mózgu myszy po długotrwałej inkubacji

Streszczenie

Źródło: Cameron, M. A., et al., Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia. J. Vis. Exp. (120), (2017)

Ten film demonstruje technikę pomiaru aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu myszy za pomocą obrazowania wapnia i zapisów elektrofizjologicznych. Poprzez perfuzję tkanki jonami potasu i rejestrowanie wewnątrzkomórkowych zmian wapnia za pomocą szybkiego obrazowania cyfrowego, metoda ta ujawnia odpowiedzi neuronalne w czasie rzeczywistym.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Ładowanie barwnika wapniowego

1. Wybierz barwniki wapniowe w oparciu o preferencje indywidualnego badacza. Tutaj używamy Fluo-8AM lub Fluo-4AM. Jednak metodę tę można zastosować również do innych barwników: rozpuścić barwniki wapniowe w DMSO do roztworu 1 mM i 1% kopolimerów blokowych (np. kwasu pluronowego-127) do końcowej objętości 50 μL i sonikować przez 10 min.
2. Dodać roztwór do płynu mózgowo-rdzeniowego o końcowym stężeniu 10 μM, 0,01% kopolimerów blokowych dla wycinków mózgu.
   1. W przypadku dorosłych zwierząt (>12 tygodni) należy pipetować barwniki (50 μl) bezpośrednio na wycinki mózgu i utrzymywać przez 75 minut, aby umożliwić lepszą penetrację barwnika do głębokich warstw.
   2. Aby zapewnić odpowiednie natlenienie zanurzonego plastra podczas inkubacji barwnika, należy przygotować szklaną komorę załadowczą z zamkniętą pokrywką (okrągły słoik o średnicy 2,5 cm, wysokości 3,5 cm) z barwnikami wapniowymi rozcieńczonymi w 2,5 ml aCSF. Natleniać w sposób ciągły 95% O₂/5% CO_{2 .} Nie bąbelkuj.
3. Po załadowaniu barwnikiem przemyć tkankę płynem CSF i przenieść ją do systemu inkubacji, powoli zmniejszając temperaturę do 15 - 16 °C, aż będzie gotowa do użycia eksperymentalnego.

2. Zapisy elektrofizjologiczne i obrazowanie

1. Umieścić tkankę w zanurzonej komorze rejestracyjnej pod mikroskopem i poddać perfuzji z natlenionym aCSF przy natężeniu przepływu 4 - 5 ml / min w temperaturze RT (~ 22 °C) lub fizjologicznej (~ 35 °C). Przytrzymaj tkankę na miejscu za pomocą wykonanej na zamówienie "harfy", wykonanej z nylonowych lub złotych nici rozciągniętych i przyklejonych do kawałka złotego lub platynowego drutu w kształcie litery U.
2. Dla elektrofizjologii:
   1. Przygotuj pipety rejestrujące ze szkła borokrzemianowego 1,5 mm (1,19 mm ID) za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać rezystancję końcową 5-6 MΩ.
   2. Napełnij pipetę 3-4 μl roztworu wewnętrznego i zobrazuj komórki w podczerwieni z kontrastem różnicowym (IR-DIC) za pomocą kamery CCD. Roztwór wewnątrzkomórkowy powinien być starannie dostosowany do każdego eksperymentu, aby osiągnąć wyniki eksperymentalne.
   3. Ustawić pipetę, utrzymując nadciśnienie wywierane przez port ssący na uchwycie pipety na membranie komórki za pomocą mikromanipulatora. Nie jest wymagane wcześniejsze skrobanie błony, ponieważ ILM został usunięty z siatkówki. Gdy pipeta znajdzie się na kuwecie, zastosuj delikatne podciśnienie do pipety, aby uzyskać gigaomowe uszczelnienie. Następnie rozerwij błonę komórkową za pomocą krótkiego podciśnienia.
   4. Wykonaj zapisy cęgów prądowych lub napięciowych całego ogniwa przy użyciu standardowych technik, w zależności od potrzeb.
3. Obrazowanie wapnia:
   1. Dla pojedynczej długości fali wzbudzenia Fluo-4 należy przefiltrować światło wzbudzenia przez filtr pasmowoprzepustowy 460 - 490 nm i wyemitować światło przez filtr pasmowoprzepustowy 515 - 550 nm. Użyj szybkiej kamery cyfrowej, aby uzyskać najszybsze i najbardziej czułe nagrywanie. Uzyskaj obrazy zgodnie z wymaganiami.
   2. Zmierz zmiany fluorescencji w funkcji czasu dla jednej długości fali (Fluo-4).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
chlorek sodu	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P9333
D-glukoza	Sigma Aldrich	Zobacz materiał G5767
Wodorowęglan sodu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał S6014
Sodu fosforan jednozasadowy	Sigma Aldrich	Zobacz materiał S2554
Chlorek magnezu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał M9272
Chlorek wapnia	Sigma Aldrich	223506
Dimetylosulfotlenek bezwodny	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Niska absorbancja UV*	Technologie życiowe	Zobacz materiał P-6867	20% roztwór w DMSO
Fluo-4 rano	Technologie życiowe	F23917
Fluo-8 rano	Księga Abcam	AB142773
Mikroskop pionowy ze stałym stolikiem	Olympus	BX51WI
Obiektyw mikroskopu	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20-krotny
Obiektyw mikroskopu	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60-krotny
Kamera CCD	Andor	Ixon +
Wzmacniacz z zaciskiem krosowym	Urządzenia molekularne	Zacisk MultiClamp 700B
System akwizycji danych	Urządzenia molekularne	Digidata 1440A	System Axon Digidata®
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Sutter Instrument Co	Zobacz materiał BF150-86-10 Zobacz materiał BF150-86-10
Ściągacz do mikroelektrod	Sutter Instrument Co	Zobacz materiał P-97	Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowego
Komora rejestrująca/perfuzyjna	Instrumenty Warnera	RC-40LP	Niskoprofilowe otwarte komory wannowe
oprogramowanie	Urządzenia molekularne	Zacisk pClamp 10.2
Oprogramowanie do obrazowania żywych komórek Andor iQ	Andor	Andor iQ3
Regulator temperatury	Technologia TE	TC-36-25 Złącze RS232