Testowanie połączeń monosynaptycznych za pomocą tetrodotoksyny i kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

Streszczenie

Źródło: Zhang, X. et al., Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych odpornych na tetrodotoksynę. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje testowanie połączeń monosynaptycznych za pomocą transgenicznej muchy. Mucha ma kanały sodowe odporne na tetrodotoksyny i kanały aktywowane czerwonym światłem w neuronach presynaptycznych, które są optogenetycznie wzbudzone do przekazywania sygnałów do neuronów postsynaptycznych.

Protokół

1. Przygotuj muchy i zidentyfikuj linie promotora GAL4

1. Wybierz linię promotora GAL4 i skrzyżuj ją z muchami przenoszącymi zarówno transgen UAS-NaChBac, jak i transgen optogenetyczny w celu aktywacji.
   nuta: UAS-CsChrimson jest wybierany ze względu na wysoką przewodność i łatwość, z jaką aktywuje potencjały czynnościowe za pośrednictwem kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę (TTX) (NaChBac). Zarówno UAS-NaChBac, jak i UAS-CsChrimson są dostępne w repozytorium Bloomington Stocks.
2. Przygotować retinal all-trans jako roztwór podstawowy w etanolu (35 mM) i przechowywać roztwór w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
3. Wymieszaj 28 μl tego bulionu z około 5 ml uwodnionego pokarmu w płatkach ziemniaczanych i dodaj tę mieszaninę do górnej części fiolki z konwencjonalnym podłożem Drosophila.
4. Wychowuj dorosłe muchy wykazujące ekspresję csChrimson na pokarmie zawierającym 0,2 mM all-trans-retinal przez 1-3 dni.

2. Przygotuj zapas TTX

1. Sporządzić roztwór podstawowy 1 mM TTX w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Przechowuj ten roztwór w lodówce laboratoryjnej przez kilka miesięcy. Zapoznaj się z polityką instytucji dotyczącą przechowywania TTX, ponieważ wiele instytucji klasyfikuje TTX jako substancję niebezpieczną lub kontrolowaną.

3. Przygotuj muchy do elektrofizjologii

1. Zbierz 1-3 jednodniowe dorosłe muchy, które są hodowane na pożywieniu za pomocą all-trans-retinal.
2. Umieść muchy w szklanej fiolce scyntylacyjnej. Umieścić fiolkę na lodzie na 1 minutę, aby unieruchomić muchy.
3. Użyj grubych kleszczy, aby włożyć muchę do specjalnie wykonanej komory nagraniowej. Komora składa się z koła 3 1/2" wyciętego laserowo z akrylu 1/16". Wytnij otwór 3/4" w środku, w którym przymocowana jest niestandardowa folia z 2-częściową żywicą epoksydową. Folia zawiera trójkątną nadzieję, do której wkłada się muchę.
4. Nałóż wosk lub żywicę epoksydową utwardzaną promieniowaniem ultrafioletowym (UV) wokół zwierzęcia, aby mocno zabezpieczyć je w komorze nagrywania.
5. Oświetl preparat światłowodem na gęsiej szyi do wizualizacji pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw włókna na gęsiej szyi na ukośne oświetlenie, regulując je tak, aby oświetlały muchę bezpośrednio z boku.
6. Dostosuj poziom światła do najniższego możliwego ustawienia, które nadal umożliwia wyraźną wizualizację muchy. To natężenie światła będzie się różnić w zależności od eksperymentu.
   nuta: Protokół ten można dostosować za pomocą metody eksplantacji mózgu in situ.
7. Pobierz zewnętrzną sól fizjologiczną do nagrywania. Sól fizjologiczna zawiera w mM: 103 chlorek sodu, NaCl, 3 chlorek potasu, KCl, 5 kwas N-tris(hydroksymetylo)metylo-2-aminoetanosulfonowy, 8 trehalozę, 10 glukozę, 26 wodorowęglan sodu,_NaHCO3, 1 diwodorofosforan sodu, NaH₂PO₄, 1,5 chlorek wapnia, CaCl₂ i 4 chlorek magnezu, MgCl₂ (dostosowany do 270–275 mΩ). Solanka jest bąbelkowana 95% O₂/5% CO₂ (karbogen) i ma pH dostosowane do 7,3.
8. Umieść 4-6 kropli zewnątrzkomórkowej soli fizjologicznej na preparacie muchowym. W tym momencie zwiększ poziom światła w mikroskopie preparacyjnym, aby uzyskać lepszą widoczność.
9. Naostrz drut wolframowy za pomocą elektrolizy. Aby wykonać drut, przygotuj nasycony roztwór azotanu potasu, KNO₃ i zastosuj około 20 V prądu przemiennego (AC), zanurzając końcówkę drutu w roztworze 20 razy na 100 ms każdy, aż końcówka zostanie naostrzona. Użyj zaostrzonego drutu wolframowego, aby usunąć naskórek na głowie muchy, odsłaniając w ten sposób mózg.
10. Dalej odsłaniaj mózg, usuwając tchawicę i otaczające go ciała tłuszczowe. Jeśli uzyskujesz dostęp do płatów anteny, użyj wygiętego drutu wolframowego lub podobnego narzędzia, aby delikatnie wsunąć anteny pod foliową komorę nagrywającą, aby zwiększyć widoczność. Użyj ostrych kleszczy, aby delikatnie oderwać poszycie glejowe pokrywające obszar zainteresowania, w którym będą wykonywane nagrania.
11. Przenieść komorę rejestracyjną na stanowisko do elektrofizjologii. Natychmiast rozpocznij perfuzję z zewnętrznym zapisem soli fizjologicznej z bąbelkami karbogenu, aby zachować mózg. Zbiornik z roztworem soli umieszcza się nad stolikiem mikroskopu i jest grawitacyjnie podawany do preparatu. Za pomocą przewodu próżniowego i kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l zebrano odpady soli fizjologicznej.

4. Uzyskaj nagranie całej komórki

1. Pociągnij pipety z plastrami na dostępnym w handlu ściągaczu do pipet. Zapoznaj się z instrukcją obsługi, aby uzyskać ustawienia, aby uzyskać odpowiednią pipetę o rezystancji końcówki bliskiej 7 mΩ.
2. Dodać 4 μl wewnętrznego roztworu rejestrującego do pipety z plastrem. Solanka wewnętrzna składa się ze 140 asparaginianu potasu, 10 kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES), 4-adenozynotrifosforanu magnezu (MgATP), 0,5 hydratu soli trisodowej 5'-trifosforanu guanozyny (Na₃GTP), 1 kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA) i 1 chlorku potasu (KCl) w mM.
3. Skonfiguruj wzmacniacz z zaciskiem krosowym do nagrywania całej komórki. Wyzeruj przesunięcie wzmacniacza i ustaw wzmacniacz tak, aby dostarczał impulsy testowe. W tym przypadku używany jest wzmacniacz z zaciskiem krosowym AM systems 2,400.
4. Zastosuj nadciśnienie przez pipetę i zbliż się do celi. Użyj mikromanipulatora, aby skierować pipetę i zetknąć się z celą. Uwolnij nadciśnienie. Ustaw potencjał utrzymywania membrany na -60 mV. Pipeta powinna tworzyć gigaomowe uszczelnienie z błoną komórki, o czym świadczy niski prąd podprądowy sub-pikoampera.
   nuta: Jeśli używasz kierowania na komórki z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), staraj się zminimalizować użycie światła epifluorescencyjnego, aby zapobiec aktywacji ChR2 i potencjalnej depresji synaptycznej. Odczekaj również kilka minut przed zastosowaniem kroku 5.
5. Ustaw wzmacniacz tak, aby dostarczał impulsy testowe od -50 mV do -60 mV. To ustawienie jest standardem we wzmacniaczach patch-clamp. Impulsy testowe ujawnią duży pojemnościowy stan przejściowy reprezentujący prąd niezbędny do naładowania pipety krosowej. Usuń pojemnościowe stany nieustalone, regulując pokrętła kompensacji pojemności na AM 2400 lub podobnym amplifier.
6. Zastosuj krótkie impulsy podciśnienia, aby rozerwać błonę komórkową i uzyskać konfigurację całej komórki.
   nuta: Konfigurację całej komórki obserwuje się, gdy następuje duży wzrost pojemnościowych stanów przejściowych pokazujących pojemność neuronu. Prawdopodobnie zaobserwowany zostanie również niewielki wzrost prądu utrzymywania (scenariusz bazowy). Ustaw wzmacniacz w aktualny tryb cęgowy i dostosuj potencjał ogniwa do -50 do -60 mV.

5. Przetestuj łączność synaptyczną

1. Skonfiguruj system akwizycji danych (DAQ) tak, aby wyzwalał sterownik diody elektroluminescencyjnej (LED) w celu generowania impulsów świetlnych. W tym przypadku system DAQ National Instruments jest używany z Matlabem do dostarczania sygnału analogowego do sterownika LED. Intensywność diody LED jest regulowana za pomocą sygnału analogowego do sterownika. Dioda LED to dioda LED o długości fali 620-630 nm.
2. Umieść czerwoną diodę LED o dużej mocy bezpośrednio pod preparatem. Dostosuj natężenie światła tak, aby 0,238 mW/^mm2 docierało do muchy.
3. Aktywuj neurony presynaptyczne podczas nagrywania z interesującej nas komórki postsynaptycznej. Osiągnij aktywację komórek optogenetycznie, farmakologicznie lub poprzez stymulację nerwów. W tym przypadku stosuje się csChrimson i krótkie impulsy czerwonego światła.
   UWAGA: Połączenia synaptyczne mogą być monitorowane w cęgach prądowych jako pobudzające potencjały postsynaptyczne (EPSP) lub cęgi napięciowe jako pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC). Połączenie synaptyczne powinno być widoczne przed zastosowaniem TTX w odpowiedzi na impuls świetlny o długości 40 ms. Jeśli nie zaobserwuje się żadnego połączenia, jest mało prawdopodobne, aby neurony były połączone synaptycznie mono- lub polisynaptycznie. Potencjał trzymania można dostosować, aby odpowiednio podkreślić połączenia pobudzające lub hamujące.
4. Jeśli zaobserwuje się połączenie w roztworze soli fizjologicznej, dodaj TTX do systemu perfuzyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM. Użyj pompy recyrkulacyjnej, aby wychwycić i ponownie wykorzystać sól fizjologiczną w celu zachowania TTX. Pompa perystaltyczna pobierze roztwór soli fizjologicznej z kąpieli i zawróci go do zbiornika soli fizjologicznej.
5. Dostosuj prędkość pompy, aby zapewnić silne stałe podciśnienie, które nie pozwala na wzrost i spadek poziomu soli fizjologicznej w kąpieli.
   nuta: Zastosowanie TTX powinno spowodować ustanie aktywności impulsowej w neuronie, który jest monitorowany w całej komórce. Potwierdza to, że do soli fizjologicznej dodano wystarczającą ilość TTX.
6. Ponownie zastosuj krótkie impulsy czerwonego światła (40 ms na każdy impuls). W tym momencie każde połączenie synaptyczne, które pozostaje, jest prawdopodobnie monosynaptyczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
UAS-csChrimson	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	Numer katalogowy: 55135	Używany jako aktywator neuronów
Bezzałogowe statki powietrzne-NaChBac	Centrum Akcji Bloomington Drosophila	Numer katalogowy: 9466	Resotores pobudliwość w komórkach w TTX
Tetrodotoksyna	Tochris	Numer katalogowy 1078	Do zakupu TTX może być potrzebne specjalne pozwolenie, ponieważ jest to substancja kontrolowana
wszystkie trans-Retinal	Sigma-Aldrichall trans-Retinal	Czynnik R2500	Wymagaj kofaktora dla rodopsyny kanałowej
Spawalna blacha ze stali nierdzewnej 321, grubość 0,002 cala, szerokość 10 cali	McMaster Carr	Numer katalogowy: 3254K7	Służy do wykonania niestandardowego uchwytu na muchy. Folia niestandardowa może być wycinana laserowo w pololu.com z dostarczonego pliku PDF
Mikroskop preparacyjny	Zeiss	Stemi 2000-C	Służy do rozwarstwiania preparatu
Wosk	Almore (Więcej)	Eectra Wosk 66000	Używany podczas preparacji do zabezpieczania muchy w folii
Wosk parafinowy	Joann	4917217	Używany z woskiem
Kleszcze numer 5	Narzędzia naukowe	#5CO	Służy do rozwarstwiania i usuwania osłon
Nożyczki preparacyjne	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 15001-08	Służy do usuwania części naskórka podczas preparacji
Drut wolframowy	Systemy A-M	Numer telefonu 797500	Stosować z elektrolizą do wykonywania zaostrzonych igieł do preparacji
Pompa perystaltyczna z recykulacją	Po prostu pompy (Amazonka)	Przekaźnik PM200S	do recyrkulacji TTX
Regulator prędkości do pompy perystaltycznej	Zitrades (Amazonka)	N/a	Kontroler ściemniania PWM do świateł LED lub wstążki, 12 V 8 Amp, regulowana jasność przełącznika światła Kontroler ściemniacza DC12V 8A 96W do taśmy LED Light B
Precyzyjny regulator sprężonego powietrza Versa-Mount	McMaster Carr	Numer katalogowy 1804T1	Do stosowania nadciśnienia podczas łatania
Kapilaria szklane	Światowe instrumenty precyzyjne	TW150F-3	Do pipet krosowych
Uniwersalny miernik	McMaster Carr	Numer katalogowy: 3846K431	Manometr do regulatora ciśnienia
Kamera do elektrofizjologii	Dage MTI	IR-1000 (wersja IR-1000	Będzie działać każda kamera pracująca w zakresie podczerwieni (850 nm). Nie chcesz używać czerwonego podświetlenia, ponieważ może to aktywować csChrimson
Dioda podczerwieni	Tholabs powiedział:	Zobacz materiał M850F2	Do oświetlenia ukośnego
Światłowód do diody IR LED	Tholabs powiedział:	Zobacz materiał M89L01	Pary do diody IR LED
Soczewka obiektywu	Olympus 40X	LUMPlanFLN	Może to być używane na większości mikroskryptów i dobrze sprawdza się w wizualizacji neuronów much.
Bursztynowa dioda LED	Tholabs powiedział:	M590L3d	Do wizualizacji zapytania ofertowego i mCherry
Niebieska dioda LED	Tholabs powiedział:	M470L3d	Do wizualizacji GFP
Zestaw filtrów GFP	Chroma	Numer katalogowy: 49011	Do wizualizacji GFP lub stymulacji rodopsyny channel2rhodopsin
Niestandardowy zestaw filtrów mCherry	Chroma	ET580/25X i T600LPXR (z zestawu 49306), ale z optyką barierowo-emisyjną ET610LP	Stosować tylko wtedy, gdy chcesz załatać zidentyfikowane neurony za pomocą rodopsyny channel2rhodopsin
Dichroiczny do łączenia bursztynowej i niebieskiej diody LED	Tholabs powiedział:	DMLP550R	Używaj tylko plastra pod mCherry i pobudzaj rodopsynę channel2 niebieskim światłem.
Czerwona dioda LED	Diody LEDSupply	Cree XPE 620 - 630 nm	Służy do napędzania csChrimson
Sterownik LED	Diody LEDSupply	3021-D-E-1000	Służy do napędzania diod LED do stymulacji optogenetycznej
Manipulator	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał MP-225	Służy do pozycjonowania pipety podczas nagrań
Wzmacniacz Patchclamp	Systemy A-M	nr wzoru 2400	Odpowiedni jest równoważny wzmacniacz
Filtr Bessela	Instrumenty Warnera	Filtr LPF 202A	Filtr pomocniczy służący do filtrowania śladu prądu do oscyloskopu podczas patchowania.
System Akwizycji Danych	Instrumenty krajowe	NI PCIe-6321 781044-01	Służy do nagrywania danych ze wzmacniacza do komputera
Blok złączy - terminal BNC BNC-2090A	Instrumenty krajowe	Nr kat. 779556-01	Służy do podłączenia wzmacniacza do karty DAQ.
Folia stalowa	McMaster Carr	Numer katalogowy: 3254K7	Folia stalowa do niestandardowej komory nagraniowej
Magnesy	K&J Magnetics	Zobacz materiał D42	Do mocowania komory nagraniowej do stojaka na pierścionek
1/16 "Cell Cast Akrylowy przezroczysty	Pololu		Służy do wykonania niestandardowej komory nagraniowej. Akryl można wycinać laserowo w pololu.com z dostarczonego pliku PDF