Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Produkcja elektrod stymulacyjnych
- Aby wykonać jedną elektrodę stymulacyjną, odetnij sześć kawałków miniaturowych przewodów połączeniowych o długości 10 cm, usuń 2 cm okładziny z jednego końca i 1 cm z drugiego końca.
- Skręć ze sobą dwa i je po krótszej, oderwanej stronie.
- Zdobądź pasek z trzema taśmami w opakowaniu dowolnego układu scalonego z obudową SOT-353 (Small Outline Transistor-353).
- Zszyj skręcone druty przez trzy otwory w opakowaniu. Dłuższy oderwany odcinek drutów powinien znajdować się we wnękach opakowania. Ułóż tak, aby koniec izolacji znajdował się w jednej linii z krawędzią otworów.
- Umieść cement dentystyczny w otworach, aby zamocować przewody.
ostrożność: Cement dentystyczny musi być wystarczająco gęsty, aby uniknąć przeciekania do wnęki opakowania.
- Gdy cement zastygnie (minimum 10 minut), odwróć opakowanie i włóż cienką warstwę superglue do otworu, aby utworzyć wodoszczelne uszczelnienie w kierunku porowatego cementu. Unikaj klejenia obranych drutów.
- Skręć razem po krótszej, oderwanej stronie i je (Rysunek 1A).
- Chwyć dłuższy, obrany odcinek drutów końcówką cienkiej pęsety, zwiń go i zawiń w wgłębienia (Rysunek 1B). W razie potrzeby odetnij nadmiar.
2. Produkcja elektrod rejestrujących
- Aby wykonać jedną elektrodę trypletową do nagrywania (rysunek 1C-D), wytnij jednocentymetrowy kawałek rurki ze stali nierdzewnej za pomocą szybkoobrotowej piły obrotowej. Zdejmij płetwę z końców rurki za pomocą ostrej igły i upewnij się, że rurka jest czysta z zanieczyszczeń i całkowicie przepuszczalna.
nuta: Nie używaj szczypiec, ponieważ mogą one zniekształcić rurkę.
- Zegnij pozłacany kołek dystansowy do deski o minimalnej długości 3 cm, aby utworzyć uchwyt w kształcie litery J. Wytnij dłuższą nogę w kształcie litery "J" i ją razem, aby przywrócić oryginalny kształt, aby utworzyć odłączalne połączenie między długą częścią liniową, która będzie utrzymywana przez urządzenie stereotaktyczne, a kształtem "U", który będzie utrzymywał elektrodę i służył jako punkt kotwiczenia. Sklej ze sobą rurkę i krótszą nogę uchwytu "J". W razie potrzeby przyklej kilka dodatkowych prętów o długości 1 cm, aby zapewnić stabilność.
- Wytnij 3 kawałki drutów elektrodowych o długości 2,5 cm za pomocą ultracienkich nożyczek ze stali nierdzewnej. Upewnij się, że cięcie jest wyraźne i ostre, a izolacja jest nienaruszona na okrągłej powierzchni drutu elektrody. Upewnij się również, że przycięta końcówka nie jest wygięta pod wpływem przyłożonej siły. Zegnij 1 lub 2 mm na jednym końcu każdego z drutów pod różnymi kątami (np. jeden w lewo prosty, jeden pod kątem 45° i jeden pod kątem prostym), aby były rozróżnialne.
- Napełnij rurkę przewodami. Dobierz odpowiedni rozstaw elektrod do eksperymentu (np. dla rejestracji potencjału lokalnego pola korowego (LFP) i gęstości źródła prądu (CSD) zalecany odstęp końcówek przewodów od otworu rurki wynosi odpowiednio 4,5 mm, 4,1 mm i 3,7 mm). Zwróć uwagę, który drut odpowiada której głębokości, aby utrzymać właściwą kolejność kanałów.
- Gdy druty ustawią się tuż obok siebie i będą równoległe do rurki, aby zamocować druty elektrody, umieść pojedynczą kroplę płynnego kleju superglue na obu końcach rurki za pomocą ostrej igły. Upewnij się, że klej spływa do rurki ze względu na efekt kapilarny, ale nie w kierunku miejsc nagrywania na wystających końcach.
- Przygotuj płytkę interfejsu elektrody z odpowiednim mikrozłączem kompatybilnym z systemem nagrywania, który ma być używany.
- Wprowadź nienagrywające, zagięte końce przewodów do otworów płytki interfejsu elektrody odpowiadających żądanemu kanałowi nagrywania. Gdy wszystkie przewody znajdą się na swoim miejscu, wepchnij złote szpilki w otwory za pomocą pęsety.
nuta: Złote szpilki można przymocować za pomocą cementu dentystycznego, ale w większości przypadków są one wystarczająco stabilne bez tego kroku bezpieczeństwa.
3. Znieczulenie
- Umieść zwierzę w szczelnie zamkniętej komorze indukcyjnej znieczulenia i napełnij ją 4 - 5% izofluranu w 2 l/min powietrza medycznego.
- Gdy szczur jest w pozycji leżącej, wyjmij zwierzę z komory i umieść je w stereotaktycznej ramie z odpowiednim noskiem wentylacyjnym.
- Ustaw poziom izofluranu na 2%, chociaż szybkość przepływu powietrza powinna pozostać taka sama. Sprawdź poziom znieczulenia. Jeśli nie ma odruchu wycofania łapy w odpowiedzi na szczypanie, kontynuuj, w przeciwnym razie zwiększ głębokość znieczulenia.
- Monitoruj i utrzymuj temperaturę ciała szczura na poziomie 37 ± 0,5 °C za pomocą homeotermicznego systemu monitorowania. Nałóż kroplę maści parafinowej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. W razie potrzeby powtórz tę procedurę kilka razy podczas zabiegu.
- Podskórnie wstrzyknąć 0,3 mg/kg atropiny, aby uniknąć tworzenia się śluzu w drogach oddechowych. W przypadku dłuższych operacji powtarzaj to co cztery godziny. Monitoruj oddech i dostosuj waporyzator, jeśli to konieczne.
4. Implantacja elektrod stymulujących i rejestrujących
UWAGA: Autoklawuj wszystkie niezbędne narzędzia chirurgiczne i dokładnie przestrzegaj ogólnych zasad aseptyki i antyseptyki podczas całego zabiegu. Unikaj dotykania niesterylnych obszarów poza obszarem operacyjnym. Zanurz elektrody w alkoholu etylowym (70%) na 30 minut przed implantacją.
- Usuń większość włosów ze skóry głowy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. Nałóż krem do depilacji na skórę głowy, rozprowadź go równomiernie na powierzchni i odczekaj kilka minut. Użyj szpatułki, aby delikatnie usunąć krem i pozostałe włosy. Spłucz skórę wodą, a następnie środkiem dezynfekującym.
- Wstrzyknąć 1 - 2% lidokainy (nie przekraczać całkowitej dawki 7 mg/kg) podskórnie w celu znieczulenia skóry. Nałóż jedną kroplę maści weterynaryjnej na oczy (np. parafiny).
- Wykonaj dokładne i długie (~2 cm) strzałkowe nacięcie w linii środkowej skalpelem od czoła do szyi. Wypreparuj tkanki, w tym okostną, z czaszki. Następnie za pomocą dłuta lub pęsety do zębów oczyść obszar między grzebieniami dwóch kości skroniowych. Cofnij wyciętą skórę za pomocą czterech buldogów, aby czaszka była odsłonięta.
- Delikatnie umieść cienką pęsetę między stromą krawędzią kości skroniowej a mięśniami i rozdziel je. Wykonuj ruchy jigowowe, aby odsłonić jak największą powierzchnię kości skroniowej, najlepiej od krawędzi kości potylicznej do płaszczyzny szwów koronalnych, nie uszkadzając przy tym mięśni.
- Umieść zwijacze dwuskroniowo, aby kości skroniowe były odsłonięte.
- Spłucz powierzchnię czaszki 1 - 2 ml 3% nadtlenku wodoru (H2O2), a następnie umyj ją 1 - 2 ml wody.
- Bardzo ostrożnie osusz powierzchnię kości skroniowych na powietrzu, usuwając wilgoć patyczkami do oczu. Sprawdź, czy elektrody stymulacyjne przylegają do oczyszczonej pionowej powierzchni czaszki (górna krawędź elektrody stymulacyjnej powinna znajdować się w jednej linii z krawędzią kości skroniowej). W razie potrzeby ponownie wyreguluj buldogi i retraktory lub uformuj elektrody stymulacyjne nożyczkami.
- Wypełnij wnęki elektrod stymulacyjnych żelem elektroprzewodzącym i nałóż cienką warstwę kleju na krawędź elektrod.
- Umieść elektrodę stymulacyjną na suchej powierzchni kości skroniowej jednym dokładnym ruchem i przytrzymaj ją mocno przez minutę za pomocą cienkiej pęsety. Upewnij się, że wilgoć nie ma kontaktu z klejem. W razie potrzeby wytrzyj patyczkami do oczu.
ostrożność: Jeśli elektroda stanie się niestabilna, wyjmij ją. Po oczyszczeniu kości powtórz ten krok z nową elektrodą stymulacyjną.
- Umieść cement dentystyczny na krawędziach elektrody stymulacyjnej, stale osuszając wilgoć przeciekającą z tkanek za pomocą patyczków do oczu. Następnie należy pokryć całą elektrodę stymulacyjną cementem.
- Po całkowitym stwardnieniu cementu powtórz te czynności po stronie przeciwnej.
- Wywierć kilka otworów w całej czaszce do zakotwiczenia. Wkręć miniaturowe w otwory i nałóż na nie cement dentystyczny. Użyj głowicy wiertarskiej o średnicy ~10% mniejszej w porównaniu ze średnicą.
- W zależności od celu eksperymentów, albo złącze do końców, umieść je na powierzchni i przykryj cementem, albo kontynuuj wszczepianie elektrod rejestrujących i światłowodów, albo przygotuj okno czaszkowe nad czaszką. W tym drugim przypadku złącza i zakotwicź je do konstrukcji dopiero na końcu. W przypadku konieczności długotrwałych jednoczesnych zapisów TES i LFP, należy wszczepić w/w trójki elektrod zamiast pojedynczych przewodów.
nuta: Taka konfiguracja pozwala na usunięcie artefaktów stymulacji w trybie wspólnym8. Szczegółowe informacje na temat rejestrowania implantacji elektrody można znaleźć w poprzednich protokołach.
- Odsłonięte tkanki obficie umyć środkiem dezynfekującym. Wstrzyknąć podskórnie 1 - 2% lidokainy (nie przekraczać całkowitej dawki 7 mg/kg).
- Oczyścić brzegi rany i zamknąć je prostymi, przerwanymi szwami wokół łącznika/implantu. Następnie zdezynfekuj ranę jodowidonem.
- Wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg karprofenu. Powtórz to, jeśli to konieczne.
nuta: Można stosować wszelkie inne leki przeciwbólowe, spełniające wymagania określone przez lokalną komisję ds. pozwoleń etycznych.
- Zawiesić znieczulenie, zwolnić kolczyki uszne i końcówkę nosa, a następnie umieścić zwierzę w klatce pooperacyjnej, aby odzyskać przytomność.
- Upewnij się, że zwierzę jest pod ścisłym nadzorem w pierwszych godzinach po operacji. Kontynuuj okresowe monitorowanie obszaru implantu.
nuta: Zwierzę nie powinno być pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Trzymaj zwierzę indywidualnie, dopóki w pełni nie wyzdrowieje po zabiegu.
