Rejestrowanie prądów synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Streszczenie

Źródło: Vasin, A., et al. Ogniskowe nagrania makropatchy prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje technikę rejestrowania prądów synaptycznych z synaptycznego połączenia nerwowo-mięśniowego larwy Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego, co jest ważne dla badania zmutowanych linii much o zwiększonej spontanicznej lub asynchronicznej aktywności synaptycznej.

Protokół

1. Produkcja elektrod rejestrujących

1. Wyciąganie szklanych elektrod
   1. Dla ściągacza mikroelektrod należy zastosować następujący protokół (patrz Tabela materiałów):
      1. Linia 1: Bieg 510 Ciągnięcie - Prędkość 30 Czas 250; Linia 2: Heat 490 Pull - Prędkość 30 Czas 250,
         nuta: Jednostki czasu odpowiadają 0,5 ms na jednostkę; Pozostałe jednostki są względne. Wartość ciepła powinna być dostosowana dla każdego żarnika po przeprowadzeniu testu rampy.
   2. Użyj mikroskopu (35-krotne powiększenie), aby upewnić się, że wewnętrzna średnica wyciąganej elektrody mieści się w zakresie 7 - 10 μm (rysunek 1A). Przechowuj kapilary w szczelnie zamkniętych pojemnikach, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.
2. Polerowanie ogniowe
   1. Wypoleruj kapilary ogniowo (80 - 90% maksymalnej wartości ciepła przez 1 - 2 s) za pomocą mikrokuźni (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że ostateczna średnica wewnętrzna polerowanej elektrody wynosi 5 μm (Rysunek 1A).
3. Gięcie
   UWAGA: Wykonuje się dwa zgięcia w celu umieszczenia elektrody na szczycie mięśnia pod obiektywem o dużym powiększeniu.
   1. Używaj aparatury pokazanej na rysunku 1B. Zamocuj elektrodę w manipulatorze i umieść końcówkę nad filamentem, nie dotykając go.
   2. Ustaw wartość grzania na 60 - 70% maksimum i naciśnij pedał mikrokuźni przez 1 - 2 sekundy (patrz Tabela materiałów), aby podgrzać filament. Użyj igły w kształcie litery L, aby delikatnie pociągnąć w dół końcówkę elektrody (rysunek 1B powiększony). Wykonaj zagięcie pod kątem około 90o (Rysunek 1C).
   3. Przytrzymaj elektrodę nad płomieniem palnika ręcznie za pomocą kleszczy i wykonaj drugie zgięcie w odległości 7 - 10 mm od pierwszego zgięcia i pod kątem około 120^o (Rysunek 1C).

2. Dodatkowe kroki przygotowawcze

1. Przygotować roztwór podobny do hemolimfy (HL3) (w mM): 70 chlorek sodu (NaCl), 5 chlorek potasu (KCl), 20 chlorek magnezu (MgCl₂), 10 wodorowęglan sodu (NaHCO₃), 5 trehaloza, 115 sacharoza, 5 kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy (HEPES) i 1 mM chlorek wapnia (CaCl₂); dostosować pH do 7,3 - 7,4. Przechowuj roztwór w lodówce i co tydzień rób świeży
.
2. Pipety stymulacyjne należy wykonywać w taki sam sposób, jak pipety szklane do nagrywania, z wyjątkiem tego, że nie ma potrzeby ich zginania.
   nuta: Przygotowanie elektrod stymulacyjnych opisano szczegółowo w punktach 28 i 27. Ostateczna średnica po polerowaniu ogniowym powinna mieścić się w zakresie 5 - 7 μm.
3. Włożyć pipetę stymulacyjną do uchwytu mikroelektrody podłączonego do strzykawki.

3. Elektryczne zapisy wzbudzających prądów połączeniowych (EJC)

1. nagranie
   1. Umieścić szalkę Petriego z preparatem na stoliku mikroskopu (ryc. 2). Włóż elektrodę odniesienia do kąpieli.
   2. Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem HL3. Pod obiektywem 10x (patrz Tabela materiałów) zanurz elektrodę w kąpieli i umieść ją na mięśniach 6 i 7 segmentów brzucha 2, 3 lub 4 za pomocą mikromanipulatora (patrz Tabela materiałów) (Rysunek 3 A.1 i A.2).
   3. Przełącz obiektyw na 60x (patrz Tabela materiałów). Skoncentruj się na obszarze zainteresowania za pomocą optyki epi-fluorescencyjnej lub DIC. Umieść końcówkę elektrody na górze synaptycznego boutonu (ryc. 3 B.1-3).
   4. Bardzo delikatnie dociśnij elektrodę do mięśnia. Nadmierne ciśnienie może uszkodzić połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) lub wywołać wzrost spontanicznej aktywności synaptycznej. Upewnij się, że końcówka elektrody nie jest zatkana - jeśli tak, wymień ją.
   5. Włącz wzmacniacz, płytę A/D i komputer.
   6. Wybierz tryb cęgów napięcia na wzmacniaczu.
   7. Uruchom oprogramowanie do akwizycji i wybierz tryb "bez przerw".
   8. Obserwuj pojawienie się miniaturowych wzbudzających prądów połączeniowych (mEJC) na ekranie komputera.
   9. Upewnij się, że amplituda mEJC mieści się w zakresie 0,2 - 0,7 nA.
      nuta: Mniejsze EJC wskazują, że elektroda rejestrująca ma wady lub nie jest prawidłowo umieszczona.
2. stymulacja
   1. Za pomocą mikromanipulatora, pod kontrolą wzrokową, umieść elektrodę stymulacyjnej, w pobliżu aksonu unerwiającego segmenty brzuszne 2 - 4.
   2. Zastosować podciśnienie, pociągając za tłok strzykawki podłączonej do uchwytu elektrody tak, aby akson został wciągnięty do wnętrza elektrody (rysunek 2).
   3. Włącz stymulator. Przekręć pokrętło na jednostce izolacyjnej (patrz Tabela materiałów), aby ustawić prąd zerowy, a następnie delikatnie go zwiększaj, aż pojawią się EJC (lub do momentu osiągnięcia progu).
   4. Stymulację należy przeprowadzić w reżimie ponadprogowym, przy wzroście prądu stymulacji około dwukrotnie, w porównaniu z progiem dla obserwacji EJCs.
      nuta: Z naszego doświadczenia wynika, że taka intensywność stymulacji jest optymalna, aby uniknąć niepowodzeń potencjału czynnościowego i wyzwolenia potencjału czynnościowego. Na przykład, jeśli EJC pojawiają się przy prądzie stymulacji 0,2 mA, użyj prądu 0,4 mA przez cały eksperyment.

Wyniki

Rysunek 1. Końcowe etapy produkcji mikropipet. (A) Końcówki elektrod po wyciągnięciu i wypolerowaniu ogniowym. (B.1) Ustawienie do gięcia końcówek. (B.2) Obszar ramki jest pokazany w powiększeniu po prawej stronie. Elektroda i żarnik są zamocowane w taki sposób, że końcówka elektrody znajduje się nieco nad drutem i nie styka się. (C.1

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrolatarka 1WG61	Ziarniak	Zobacz materiał 1WG61	Mikropalnik
Olympus BX61WI	Olympus	BX61WI	Mikroskop pionowy
Olympus Lumplan FL N 60x	Olympus	UPLFLN 60X	Obiektyw mikroskopowy 60X
Olympus UPlan FL N 10x	Olympus	Uplanfl N 10X	Obiektyw mikroskopu 10X
Mikromanipulator Narishige	Narishige powiedział:	Samolot MHW-3	Trójosiowy mikromanipulator hydrauliczny wody
npi Electronic GmbH ELC-03XS	npi Electronic GmbH	ELC-03XS	Wzmacniacz elektrofizjologiczny
Mistrz A.M.P.I 8	A.M.P.I.	Mistrz 8	Stymulator elektryczny
A.M.P.I Iso-Flex	A.M.P.I.	Iso-Flex (Izo-Elastyczny	Izolator bodźca
Stół antywibracyjny TMC	TMC (Międzynarodowa Organizacja T	63-9090	Stół antywibracyjny
Klatka Faradaya TMC	TMC (Międzynarodowa Organizacja T	Numer katalogowy: 81-333-90	Klatka Faradaya
Digidata 1322A	Instrumenty firmy Axon	Digidata 1322A	Digidata (dane cyfrowe)
komputer	dolina	Komputer Dell Dimension 5150	Komputer z systemem operacyjnym Win XP
Uchwyt elektrody	Wskaźnik WPI	MEH3SW	Uchwyt elektrody
Filtr optyczny	Optyczny Omega	Zobacz materiał XF 115-2	Kostka filtracyjna do wykrywania białka zielonej fluorescencji (GFP)
pCLAMP 8 (zacisk 8	Instrumenty firmy Axon	8.0.0.81	Oprogramowanie do rejestracji sygnału
Kwantan	Własne oprogramowanie	-	Oprogramowanie do przetwarzania sygnałów
Canton-S (Wildtype)	Centrum Magazynowe w Bloomington	Numer katalogowy: 64349	Linka kontrolna muchowa
cpx SH1	Hojny dar J.T. Littletona	-	Linia muchowa z nokautem Complexin ze zwiększoną spontaniczną egzocytozą
CD8-GFP (Płyta CD8-GFP)	Centrum Magazynowe w Bloomington	5137	Linia muchowa z znacznikiem fluorescencji neuronalnej (GFP)

TGL ) TGL powiedział: ) powiedział: SZT.