Zautomatyzowana technika zaciskania krosowego sterowana obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Streszczenie

Źródło: Wu, Q., et al. Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2017).

W tym filmie wycinki mózgu są unieruchomione w komorze nagraniowej, a interesujące komórki są lokalizowane i skupiane za pomocą mikroskopu sterowanego komputerowo. Zautomatyzowany system przetwarzania obrazu precyzyjnie ustawia pipetę z plastrem w celu uszczelnienia błony komórkowej i monitorowania sygnałów elektrycznych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Ustawienia systemu

1. Zbuduj jednostkę sterującą ciśnieniem.
   1. Zamontuj jednostkę regulacji ciśnienia zgodnie z mapą obwodu (rysunek 1). niezbędne części do płytki obwodu drukowanego (PCB) wyprodukowanej zgodnie ze schematami obwodów elektrycznych (rysunek 1b). Używaj standardowych rezystorów, diod LED (diod elektroluminescencyjnych), tranzystorów polowych (MOSFET) z tlenku metalu i tlenku, kondensatorów i złączy. zawory elektromagnetyczne do płytki drukowanej (płytki drukowanej). Podłącz pompę powietrza i czujnik ciśnienia powietrza do płytki drukowanej za pomocą przewodu elektrycznego.
      UWAGA: Po udostępnieniu wszystkich niezbędnych części jednostka sterująca ciśnieniem powinna zostać zbudowana w ciągu około 2 godzin.
2. Podłącz płytę wtórnego akwizycji danych (DAQ).
   1. Podłącz wyjścia danych z płytki drukowanej do płytki DAQ, postępując zgodnie z tabelą 1.
      nuta: Płyta DAQ będzie działać w "trybie Single-ended". Mapa portów znajduje się w instrukcji obsługi (patrz Tabela Materiałów).
   2. Podłącz "AIn Pr S" do jednego z kanałów wejścia analogowego (AI), a "R-Gr" do jednego z analogowych uziemień na wtórnej płycie DAQ.
   3. Podłącz główne wyjście ze wzmacniacza do jednego z kanałów AI, a masę do masy analogowej wtórnej płyty DAQ.
      UWAGA: Do podłączenia głównego wyjścia ze wzmacniacza można użyć standardowego BNC.
   4. Zdejmij drugi koniec i podłącz sygnał dodatni (tj. rdzeń miedziany) do kanału AI, a masę (tj. cienki drut wokół rdzenia) do uziemienia analogowego. Powtórz ten krok dla drugiego kanału, jeśli używany jest więcej niż jeden kanał patch.
      UWAGA: Wejście analogowe do karty DAQ zostanie skonfigurowane w późniejszych krokach.
   5. Podłącz zasilanie do wyjścia zasilania dodatkowej płyty DAQ. Użyj oddzielnego źródła zasilania 12 V dla pompy.
3. Podłącz rurkę.
   1. Podłącz pompę powietrza i dwa zawory.
   2. W ostatnim kroku użyj 3-drożnego złącza, aby podłączyć miękki przewód z górnego portu zaworu 2 do czujnika ciśnienia i uchwytu na pipety.
   3. Jeśli używane są dwie pipety, dodaj kolejne złącze 3-stykowe do rurki podłączonej do uchwytu na pipety. Podczas łatania należy ręcznie przełączać się między używanymi zaworami a pipetami.
4. Zainstaluj Autopatcher IG.
   UWAGA: Wymagania systemowe: Autopatcher IG został przetestowany tylko na komputerze z systemem Windows 7. Nie został zweryfikowany dla innych systemów operacyjnych. Opisana procedura dotyczy w szczególności sprzętu wymienionego w Tabeli materiałów.
   1. Pobierz Autopatcher-IG z GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Zainstaluj Pythona (zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z wersją i adresem pobierania).
   3. Odinstaluj bibliotekę PyQt4, wpisując "uninstall PyQt4" w terminalu wiersza poleceń.
      nuta: System korzysta ze starszej wersji biblioteki PyQt4, aby osiągnąć kompatybilność z bibliotekami Qwt i Opencv.
   4. Zainstaluj biblioteki języka Python z historycznych plików kół (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Znajdź następujące pliki: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) i Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Aby zainstalować pliki wheel, przejdź do katalogu, w którym pliki są zapisane i wpisz "install ***wheelfilename***.whl". Zastąp "***wheelfilename***" rzeczywistą nazwą pliku.
         UWAGA: "cp27" w nazwie pliku koła oznacza Python 2.7, a "win32" oznacza 32-bitowy system Windows. Jeśli "win32" nie działa, spróbuj "win64".
   5. Aby sterować kamerą CCD (urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym), pobierz i zainstaluj instalator dla wersji 64-bitowej (https://www.qimaging.com/support/software/). Następnie pobierz MicroManager dla wersji 64-bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release), aby sterować kamerą w Pythonie.
   6. Aby sterować manipulatorami i stolikiem mikroskopu, należy zainstalować oprogramowanie sterujące dostarczone przez producenta.
      nuta: W ten sposób instalowany jest również sterownik niezbędny do sterowania manipulatorami. Pakiet instalacyjny jest zwykle dostarczany na płycie CD-ROM.
   7. Aby sterować dodatkową płytą DAQ, zainstaluj bibliotekę uniwersalną z płyty CD-ROM, dołączonej do zakupionej płyty DAQ.
5. Skonfiguruj sprzęt dla Autopatcher IG.
   1. Podłącz stolik mikroskopu i sterowniki manipulatora do komputera za pomocą portów USB.
   2. Przypisz numery portów COM do jednostki 0: stolik mikroskopu, jednostki 1: lewy manipulator i jednostki 2: prawy manipulator, w tej kolejności, w pliku konfiguracyjnym "ports.csv" w folderze "configuration". Pozostałe parametry w pliku ports.csv (np. "SCI" i "1") pozostaw bez zmian.
      nuta: Informacje o numerze portu COM można znaleźć, uruchamiając oprogramowanie konfiguracyjne manipulatora dostarczone przez producenta. Przejdź do zakładki "ustawienia", wybierz "ustawienia" i stronę "Ruch", a następnie przeczytaj etykiety dla każdej zakładki u góry. Alternatywnie informacje te można znaleźć w Menedżerze urządzeń PC.
   3. Przypisz numery kanałów wejściowych analogowych na płytce DAQ dla czujnika ciśnienia i kanału krosowego 1 i 2 (odpowiadających jednostce 1 i 2). Wprowadź numer kanału w pliku "DAQchannels.csv" w folderze "configuration".
      nuta: Zaleca się otwieranie plików .csv za pomocą aplikacji Notatnik zamiast arkusza kalkulacyjnego, ponieważ może to zmienić informacje podczas zapisywania zmian.
6. Uruchom Autopatcher IG.
   1. Włącz amplifier, kontroler mikroskopu i kontroler manipulatora. Upewnij się, że amplifier oprogramowanie jest uruchomione.
   2. Uruchom Autopatcher IG z Pythonem z terminala wiersza poleceń w następujący sposób: najpierw zmień katalog (polecenie "cd" dla najpopularniejszych terminali), w którym zainstalowany jest Autopatcher IG, wpisz "python Autopatcher_IG.pyw" w terminalu wiersza poleceń i naciśnij "Enter".
      UWAGA: Nie uruchamiaj oprogramowania sterującego manipulatorem przed uruchomieniem Autopatcher IG, ponieważ zajmie ono stolik mikroskopu i manipulator, powodując, że Autopatcher IG nie będzie w stanie znaleźć sprzętu. Oprogramowanie sterujące manipulatorem może być uruchomione po pełnym uruchomieniu Autopatcher IG, jeśli istnieją dodatkowe moduły do sterowania (np. grzałka liniowa).
7. Skalibruj pipetę główną.
   1. Wyciągnij pipety z plastrami. Napełnij wyciągniętą szklaną pipetę roztworem wewnętrznym i załaduj ją na stopień głowicy.
      UWAGA: Puste szklane pipety mają różny kontrast pod mikroskopem i mogą prowadzić do niedokładnej kalibracji.
   2. Przesuń końcówkę pipety w stronę pola widzenia mikroskopu i ustaw na niej ostrość. Jeśli klawiatura numeryczna jest używana do przesuwania manipulatorów i/lub stolika mikroskopu, zaktualizuj współrzędne, naciskając "z" na klawiaturze.
      nuta: Czynność ta nie jest konieczna, jeśli klawiatura (stolik mikroskopu: A/D - oś x, W/S - oś y, R/F - oś z; manipulatory: H/K - oś x, U/J - oś y, O/L - oś z, 1/2 - numer jednostki) jest używana do sterowania ruchem, ponieważ współrzędne będą aktualizowane w czasie rzeczywistym.
   3. Kliknij przycisk "Rozpocznij kalibrację" w głównym graficznym interfejsie użytkownika (GUI) dla odpowiedniego urządzenia, do którego załadowana jest pipeta (Rysunek 2).
      nuta: Po zakończeniu kalibracji pojawi się wyskakujące okienko.
      UWAGA: Kalibracja zostanie przeprowadzona automatycznie, co zajmie około 3,5 minuty. Kliknięcie tego samego przycisku (przełączonego teraz na "anuluj kalibrację" po rozpoczęciu kalibracji) spowoduje przerwanie próby kalibracji.
   4. Zapisz kalibrację, klikając "zapisz kalibrację" na dole głównego GUI (zapisuje bieżącą kalibrację dla obu manipulatorów i można ją załadować w przyszłości).
      UWAGA: Pole widzenia przy małym (4 lub 10x) i wysokim (40x) powiększeniu musi być wyrównane, aby kalibracja wtórna działała prawidłowo. Aby zapoznać się z procedurami wyrównywania, należy zapoznać się z instrukcją obsługi używanego układu optycznego.
       

2. Procedura automatycznego zaciskania łatki

1. Przygotuj ostre plasterki mózgu
2. Przygotuj szklane pipety do zacisku krosowego.
3. Umieść jeden plasterek mózgu na środku komory nagraniowej. Ustabilizuj plasterek za pomocą przytrzymania plasterka lub "harfy".
4. Wykryj komórkę fluorescencyjną.
   1. Znajdź obszar zainteresowania pod obiektywem 4X. Przesuń stolik mikroskopu, włączając tryb "kliknij, aby przenieść" ("CTM") i klikając środek obszaru zainteresowania. Alternatywnie, użyj klawiatury, aby przesunąć stolik mikroskopu (A/D - oś x, W/S - oś y, R/F - oś z).
   2. Przełącz się na obiektyw o dużym powiększeniu i wyreguluj ostrość, przesuwając mikroskop w osi z, używając R/F na klawiaturze.
      UWAGA: Zaleca się wyregulowanie poziomu kąpieli wodnej tak, aby płaszczyzna ogniskowej pod obiektywami o małym i dużym powiększeniu była taka sama lub podobna w osi z.
   3. Kliknij przycisk "Wykryj komórkę" w głównej kolumnie graficznego interfejsu użytkownika, "Jednostka 0". Jeśli dioda LED lub laserowe źródło światła konfiguracji nie może być sterowane sygnałem TTL, ręcznie włącz diodę LED/laser; po zakończeniu wykrywania komórki pojawi się wyskakujące okienko.
      1. W razie potrzeby wyłącz diodę LED/laser; lista współrzędnych komórek pojawi się w graficznym interfejsie użytkownika "Pozycje pamięci". Usuń niechciane komórki z listy, klikając przycisk "X" obok współrzędnych.
      2. Alternatywnie, jeśli komórki docelowe nie są oznaczone fluorescencyjnie, kliknij "Tryb myszy" w głównym graficznym interfejsie użytkownika. Kliknij komórkę, która Cię interesuje; na komórce pojawi się żółta kropka z liczbą, a współrzędne komórki pojawią się w graficznym interfejsie użytkownika "Pozycje pamięci".
5. Skalibruj pipetę wtórną.
   1. Napełnij 1/3 szklanej pipety roztworem wewnętrznym. Załaduj pipetę do uchwytu na pipetę przymocowanego do głowicy.
   2. Użyj obiektywu o małym powiększeniu. Umieść pipetę w polu widzenia i wyreguluj ostrość za pomocą klawiatury (H/K - oś x, U/J - oś y, O/L - oś z). Użyj "1" i "2", aby przełączać się między jednostką 1 a jednostką 2.
   3. Załaduj kalibrację podstawową, klikając "Załaduj kalibrację". Kliknij przycisk "Kalibracja wtórna" w głównym graficznym interfejsie użytkownika pod używanym urządzeniem. Na przykład, jeśli używana jest jednostka 2, kliknij przycisk "Kalibracja wtórna" w kolumnie "Jednostka 2". Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi w wyskakującym okienku, aby przełączyć się na obiektyw o dużym powiększeniu.
6. Łatanie komórki docelowej.
   1. Upewnij się, że oprogramowanie "MultiClamp" (tj. amplifier) jest uruchomione. Kliknij przycisk "Kontrola poprawki", aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika "Kontrolka poprawki"; otwarcie tego graficznego interfejsu użytkownika może potrwać do kilku minut.
   2. Użyj obiektywu z 40-krotnym powiększeniem, sprawdzając "40X" w głównej kolumnie "Jednostka 0" w graficznym interfejsie użytkownika. Kliknij przycisk "idź do" obok interesującej Cię komórki na liście współrzędnych w graficznym interfejsie użytkownika "Pozycja pamięci"; Mikroskop przeniesie się do komórki.
   3. Kliknij przycisk CTM używanej jednostki w głównym graficznym interfejsie użytkownika, aby umożliwić ruch po kliknięciu myszą. Kliknij komórkę, która Cię interesuje; Końcówka pipety przesunie się do celi.
   4. Kliknij przycisk "Łatka" w graficznym interfejsie użytkownika "Kontrola poprawek".
      nuta: Rozpocznie się automatyczne łatanie, a ciśnienie i opór można monitorować w graficznym interfejsie użytkownika "Kontrola poprawek".
      1. Użyj przycisku "Wybrano jednostkę 1", aby przełączyć sygnał wejściowy między dwiema jednostkami.
         UWAGA: System zbliży się do komórki docelowej, zastosuje podciśnienie, dopasuje potencjał błony komórkowej i wykryje tworzenie się gigaseal w oparciu o szereg progów ciśnienia i oporu oraz logikę.
      2. Manipuluj automatycznym procesem w dowolnym momencie, klikając odpowiednie przyciski w graficznym interfejsie użytkownika "Kontrola poprawek". Na przykład kliknij ponownie przycisk "Łatka", aby anulować wersję próbną poprawki, a następnie kliknij "Następny etap", aby przejść proces łatania do następnego kroku, niezależnie od progu.
         UWAGA: Wyskakujące okienko powiadomi użytkownika o utworzeniu gigaseal i zostanie przedstawiona opcja zastosowania zap wraz z dużym podciśnieniem.
   5. Wybierz "Tak", aby włamać się z połączonym zap-em i ssaniem. Alternatywnie wybierz "Nie", aby włamać się tylko z ssaniem.
      UWAGA: Po pomyślnym zakończeniu łatania całej komórki wyskakujące okienko przypomni użytkownikowi o zapisaniu dziennika poprawek eksperymentu.
   6. Zapisz dziennik poprawek eksperymentu.
      UWAGA: Jeśli próba instalowania poprawek nie powiedzie się, użytkownik zostanie o tym powiadomiony w wyskakującym okienku, a proces łatania zostanie zresetowany.
   7. Wróć do kroku 2.4 i powtórz kroki z inną komórką.

Wyniki

Tabela 1. Konfiguracja połączenia płytki drukowanej (PCB) z płytką wtórnej akwizycji danych (DAQ). Użyj tej tabeli, aby podłączyć wyjścia PCB (pierwsza kolumna od lewej) do portów na płycie DAQ (druga kolumna od lewej). Nazwa i numer portu na pomocniczym DAQ odnoszą się do trybu single-ended.

Wylot na płytce drukowanej

Nazwa portu na płycie DAQ

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamera CCD	Planowanie jakości	Śruba Rolera
Stanowisko do elektrofizjologii	Scientifica (Nauka)	SliceScope Pro 2000	Dołącz mikroskop i manipulatory. Dostarczone przez producenta oprogramowanie sterujące manipulatorem pokazane w tym manuskrypcie to "Linlab2".
wzmacniacz	Urządzenia molekularne	Zacisk MultiClamp 700B	sterowany komputerowo wzmacniacz mikroelektrod
Digitizer	Urządzenia molekularne	Axon Digidata 1550
Źródło światła LED	Fajna dioda LED	pE-100	Długość fali 488 nm
Tablica akwizycji danych	Obliczenia pomiarowe	USB1208-FS	Wtórny DAQ. Zobacz instrukcję pod adresem: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Zawory elektromagnetyczne	Firma Lee Co.	LHDA0531115H
Pompa	Wirtualny przemysł	VMP1625MX-12-90-KANAŁOWY
Czujnik ciśnienia powietrza	Półprzewodnik z dowolną skalą	MPXV7025G
Przytrzymanie plasterka	Instrumenty Warnera	64-1415 (SHD-40/2)	Zestaw kotew Slice, płaski do studzienki RC-40, 2.0 mm, 19.7 mm
pyton	anakonda	Wersja 2.7 (32-bitowa dla systemu Windows)	https://www.continuum.io/downloads
Zaciski śrubowe (2-pinowe)	Zabawa z iskrą	PRT - 08084	Zaciski śrubowe o rastrze 3,5 mm (2-pinowe)
Tranzystor MOSFET z kanałem N: 60V 30A	Zabawa z iskrą	COM - 10213
Gniazda DIP Końcówka lutowana - 8-pin	Zabawa z iskrą	PRT-07937
Dioda LED - Podstawowa Czerwona 5mm	Zabawa z iskrą	COM-09590
Dioda LED - Podstawowa Zielona 5mm	Zabawa z iskrą	COM-09592
Gniazdo/złącze zasilania beczki DC (SMD)	Zabawa z iskrą	PRT-12748
Zasilacz sieciowy - 12VDC 600mA	Zabawa z iskrą	TOL-09442
Przewód połączeniowy - zestaw (Solid Core, 22 AWG)	Zabawa z iskrą	PRT-11367
Blokowanie krana męskiego x żeńskiego x żeńskiego	ARK-PLAS	Zobacz materiał RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Elastyczne rurki	Fisher naukowy	14-171-129	Średnica zewnętrzna: 1/8 cala. Średnica wewnętrzna: 1/16 cala
koncentryczny BNC męski na BNC męski	Komponenty Belkin	F3K101-06-E
Rezystor 560 Ohm (tolerancja 5%)	Radioshack (Radioshack	2711116
Picospritzer	Zawór ogólny	Picospritzer II