Zapis elektrofizjologiczny nerwów doprowadzających okrężnicy w okrężnicy szczurzej okrężnicy

Streszczenie

Źródło: Meng, Y. et al., In vitro Charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych włókien doprowadzających okrężnicy u szczurów. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje metodę rejestrowania aktywności nerwów doprowadzających okrężnicy w okrężnicy szczura ex-vivo, kaniulowanej na obu końcach i podawanej solą fizjologiczną w celu zwiększenia ciśnienia śródświetlnego. Wraz ze wzrostem ciśnienia sygnał nerwowy wzrasta, wskazując na jego stymulację.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie roztworu perfuzyjnego i badanych związków

1. Przygotuj 5 l roztworu Krebsa: 113 mM chlorku sodu, NaCl, 5,9 mM chlorku potasu, KCl, 1,2 mM diwodorofosforanu sodu, NaH₂PO₄, 1,2 mM siarczanu magnezu, MgSO₄, 25 mM wodorowęglanu sodu, NaHCO₃, 1,2 mM chlorku wapnia, CaCl₂ i 11,5 mM glukozy. Nasycić roztwór mieszaniną gazów o stężeniu 95%_O2 + 5%_CO2. Wstępnie schłodzić ~500 ml natlenionego Krebsa w lodówce.
2. W razie potrzeby przygotować podwielokrotności podstawowych związków badanych (1 mM kapsaicyny w etanolu i 10 mM 5-hydroksytryptaminy (5-HT) w soli fizjologicznej). Rozcieńczyć wywar w roztworze Krebs (do kąpieli) i w soli fizjologicznej (do podawania doświetlnego) do końcowego stężenia tuż przed użyciem.

2. Przygotowanie elektrody rejestrującej

1. Wyciągnij elektrodę rejestrującą ze standardowych szklanych rurek bez wewnętrznych żarników (średnica zewnętrzna 1,5 mm) za pomocą konwencjonalnego ściągacza elektrod. Dostosuj ustawienia ściągacza do ciepła i pociągnij tak, aby trzpień ciągniętych elektrod znajdował się między 20 a 25 mm.

3. Pobieranie tkanek

1. Dokładnie znieczulić szczura za pomocą pentobarbitalu sodu (80 mg/kg, i.p.).
2. Zapewniając sterylność, należy odsłonić jamę brzuszną, wykonując nacięcie w linii środkowej ściany brzucha za pomocą skalpela. Odciągnij krezkę i inne tkanki na bok, aby odsłonić jelito grube.
3. Umieść zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym. Poprzez staranną sekcję zlokalizuj lewy ganglion miednicy (PG) i zidentyfikuj łączące się z nim nerwy miednicy (PN) i nerwy splanchniczne lędźwiowe (LSN). Przetnij te nerwy kilka milimetrów od PG.
   nuta: PG leży blisko połączenia jelita grubego. Zazwyczaj 3 - 4 PN z rdzenia kręgowego lędźwiowo-krzyżowego i projekt LSN do PG (ryc. 1).
4. Przetnij kość spojenia, aby odsłonić odbytnicę. Usuń tkanki (tj. pęcherz moczowy itp.) powyżej jelita grubego; uważaj, aby pozostawić PG nienaruszony.
5. Złóż szczura w ofierze przez dożylne wstrzyknięcie przedawkowania pentobarbitalu. Przeciąć okrężnicę około 3 cm powyżej PG i usunąć jelito grube ze zwierzęcia za pomocą kleszczy.
6. Przenieść jelito grube na szalkę Petriego wypełnioną wstępnie schłodzonym roztworem Krebsa. Usuń kał, delikatnie spłukując okrężnicę. Ostrożnie usuń resztki pęcherza moczowego i inne tkanki, nie naruszając PG.

4. Rozwarstwienie nerwów doprowadzających okrężnicy

1. Umieścić okrężnicę w komorze rejestracyjnej (20 ml) i w sposób ciągły perfundować tkankę karbonogennym roztworem Krebsa. Ustaw szybkość perfuzji na 15 ml/min.
2. Kanniulacja jelita grubego zarówno na końcu ustnym, jak i odbytowym. Rozpocząć infuzję doświetlną okrężnicy solą fizjologiczną z szybkością 10 ml/h w kierunku doustnym do odbytu.
3. Zlokalizuj główny PG pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj szpilek przeciw owadom, aby odsłonić ganglion. Po dokładnym rozbiorze znajdź cienką gałąź nerwu wychodzącą ze zwoju i biegnącą w kierunku okrężnicy (ryc. 1). Przetnij nerw w pobliżu ganglionu.
   UWAGA: Rysunek 1 ilustruje nagranie z gałęzi nerwowej dystalnej do PG. Nerw prawdopodobnie zawiera mieszaninę włókien doprowadzających miednicy i odcinka lędźwiowego splanchnicznego. Alternatywnie można dokonać zapisu z PN i/lub LSN proksymalnie do PG.
4. Włączyć łaźnię grzewczą i podgrzać roztwór Krebsa, aby utrzymać temperaturę komory na poziomie 34 ± 0,5 °C.

5. Przygotowanie elektrody ssącej

1. Weź wstępnie wyciągniętą szklaną pipetę (krok 2) i sprawdź ją pod mikroskopem preparacyjnym. Złamać końcówkę elektrody za pomocą kleszczy tak, aby miała rozmiar zgodny ze średnicą nerwu, który ma być rejestrowany.
2. Skoś końcówkę, umieszczając ją w pobliżu jaśniejszego rozbłysku.

6. Zapis elektrofizjologiczny

1. Podłącz skośną elektrodę do uchwytu elektrody. Podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do bocznego portu na uchwycie, aby wywrzeć podciśnienie lub nadciśnienie na elektrodzie.
2. Podłącz uchwyt do stopnia głównego bioamplifier i zamontuj stopień główny na manipulatorze.
3. Przenieś elektrodę do kąpieli tkankowej i napełnij elektrodę roztworem Krebsa, delikatnie odsysając, aż zetknie się ze srebrnym drutem uchwytu. Umieść końcówkę elektrody blisko przeciętego końca nerwu i zastosuj podciśnienie, aby zassać nerw do elektrody. Zastosuj większe podciśnienie, aby ~1 mm nerwu został wciągnięty do elektrody i utworzył szczelne uszczelnienie.
4. Włącz biowzmacniacz i ustaw filtr na 300 - 3 000 Hz. Monitoruj sygnał na oscyloskopie i rejestruj sygnał nerwowy (częstotliwość próbkowania 20 kHz) oraz sygnał ciśnienia śródświetlnego (częstotliwość próbkowania 100 Hz) za pomocą komputera z oprogramowaniem do przetwarzania danych skokowych.

7. Testowanie wrażliwości doprowadzającej okrężnicy

1. Zastosuj rampowe rozdęcie okrężnicy, zamykając trójkierunkowy kran na kaniuli wylotowej, jednocześnie stale wlewając się śródświetlnie. Monitoruj ciśnienie śródświetlne, aż osiągnie 60 mmHg, po czym otwórz trójdrożny kran na kaniuli drenującej.

Wyniki

Rysunek 1. Zapis elektrofizjologiczny nerwów doprowadzających okrężnicy szczura in vitro. ZA. Schematyczna ilustracja preparatu jelita grubego ex vivo "rurkowego" u szczura. Jelito grube, z dołączonym PG, jest nadmiernie rośnięte w komorze nagraniowej i jest kaniulowane na obu końcach. Wlew doświetlny uzyskuje się za pomocą pompy strzykawkowej i porusza się w kierunku ustnym do odb...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pentobarbital sodu	Szanghaj Westang Bio-Tech	Zobacz materiał B558
kapsaicyna	Sigma	Zobacz materiał M2028
Ściągacz elektrod	MicroData Instrument Inc	PMP107
System Neurolog (Biowzmacniacz)	Digitimer, Sp. z o.o	System neurologiczny
Przetwornik A/C	Projektowanie elektroniczne Cambridge	Mikro1401
Oprogramowanie do przetwarzania danych	Projektowanie elektroniczne Cambridge	Spike2 wersja 6
Srebrny drut	Światowe instrumenty precyzyjne	EP12 (wersja
Rurki szklane	Światowe instrumenty precyzyjne	pozycji 1B150-4
Uchwyt elektrody	Światowe instrumenty precyzyjne	MEH3SBW
Łaźnia grzewcza	dotacja	GR150
Mikroskop preparacyjny	Księga Leica	Powiększenie 2000
Mikroskop preparacyjny	Światowe instrumenty precyzyjne	PZMIII-BS
Zapalniczki	jakikolwiek	nie
Narzędzia chirurgiczne	Światowe instrumenty precyzyjne	nie
Szpilki do owadów	domowej roboty z drutu ze stali nierdzewnej o grubości 0,1 mm	nie
Manipulator trójdrożny	Światowe instrumenty precyzyjne	KITF-R
Szczury	jakikolwiek	nie	Można użyć dowolnej odmiany/płci.

(wersja angielska) . powiedział: angielska)