Ocena funkcji mitochondriów w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

Streszczenie

Źródło: Rellick, S. L. et al. Ocena funkcji bioenergetycznej w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje ocenę funkcjonowania mitochondriów komórek śródbłonka naczyń mózgowych (CVE) za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Komórki CVE są siane na płytce do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego. Czujniki strumienia zewnątrzkomórkowego są nawilżane przed załadowaniem i kalibracją do bioanalizatora. Płytka zawierająca komórki jest następnie ładowana do analizy.

Protokół

1. Wysiewanie i traktowanie komórek śródbłonka naczyń mózgowych (CVE) na płytkach do hodowli komórkowych

1. Nasiona komórek CVE (komórki bEnd.3) na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego: 80 μl / dołek. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .} Uwaga: 16 × 10³ komórki na studzienkę osiągną 60 - 80% konfluencji w ciągu 24 godzin.
2. Jeśli komórki są wystawione na działanie substancji chemicznej, dodaj zabiegi, gdy komórki zostaną przymocowane do dna płytki (8 - 24 godziny po wysianiu).
   nuta: W przypadku eksperymentów z transfekcją nie należy dodawać antybiotyków do kompletnej pożywki wzrostowej.

2. Ocena funkcji mitochondriów za pomocą bioanalizatora

1. Przed rozpoczęciem badania należy uwodnić wkład czujnika strumienia zewnątrzkomórkowego z kalibrem, dodając do płytki 150 μl roztworu kalibru strumienia zewnątrzkomórkowego i inkubując przez noc w temperaturze 37 °C bez CO₂ .
2. Za pomocą stacji myjki płytkowej zmień pożywkę do hodowli komórkowych na pożywkę do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego o pH 7,0. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C bez CO₂ przez 30–60 minut.
3. Przygotować roztwory robocze 8 μM oligomycyny, 4,5 μM 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu karbonilcyjanku (FCCP), 10 μM rotenonu i 10 μM antymycyny A w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Załadować 25 μl roztworów podstawowych do portów iniekcji wkładu: port A, oligomycyna; Port B, FCCP; Port C, rotenon i antymycyna A z pożywką do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego. Wdrożyć protokół oznaczania zgodnie z opisem w tabeli 1.
4. Załaduj uwodniony wkład do bioanalizatora i przeprowadź kalibrację, klikając przycisk "Start". Po zakończeniu kalibracji zdejmij dolną płytę wkładu i załaduj płytkę ogniwa, klikając monit "Rozładuj wkład". Kontynuuj test, aż wszystkie pomiary zostaną zakończone.
5. Otwórz plik danych i uzyskaj wartości szybkości z bioanalizatora. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego.

Tabela 1. Protokół uruchomienia instrumentu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa bEnd.3	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-2299	25-30 przejść
Zmodyfikowany Medium Orła Dulbecco (DMEM)	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2002
Surowica bydlęca płodu	Atlanta Biologicals	Zobacz materiał S12450	10% w finale
Penicylina/steptomycyna	Klon	SV30010	Pończochy 1×100
0,25% trypsyna 0,03% roztwór EDTA	Corning	25-053-CI
Pirogronian sodu	Corning	25-000-CI	1,0 μM w finale
glukoza	Sigma	CAS 50-99-7	25 mM w finale
Oligomycyna	Sigma	Numer telefonu O4876	1,0 μM w finale
4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon karbonilcyjanku (FCCP)	Sigma	Zobacz materiał C2920	0,5 μM w końcówce
Rotenon	Sigma	Czynnik R8875	1,0 μM w finale
Antymycyna A	Sigma	CAS 1397-94-0	1,0 μM w finale
Stacja mycia płyt	Nauka biologiczna konika morskiego
Bioanalizator strumienia zewnątrzkomórkowego	Nauka biologiczna konika morskiego	XFe96
Płytka do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego	Nauka biologiczna konika morskiego	Numer katalogowy: 102416-100
Wkład czujnika strumienia zewnątrzkomórkowego	Nauka biologiczna konika morskiego	Numer katalogowy: 102416-100
Roztwór kalibru strumienia zewnątrzkomórkowego	Nauka biologiczna konika morskiego	Numer katalogowy: 100840-000
Pożywka do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego	Nauka biologiczna konika morskiego	Numer katalogowy: 102365-100	PH buforowane przed badaniem

powiedział: