$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Wysiewanie i traktowanie komórek śródbłonka naczyń mózgowych (CVE) na płytkach do hodowli komórkowych
- Nasiona komórek CVE (komórki bEnd.3) na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego: 80 μl / dołek. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Uwaga: 16 × 103 komórki na studzienkę osiągną 60 - 80% konfluencji w ciągu 24 godzin.
- Jeśli komórki są wystawione na działanie substancji chemicznej, dodaj zabiegi, gdy komórki zostaną przymocowane do dna płytki (8 - 24 godziny po wysianiu).
nuta: W przypadku eksperymentów z transfekcją nie należy dodawać antybiotyków do kompletnej pożywki wzrostowej.
2. Ocena funkcji mitochondriów za pomocą bioanalizatora
- Przed rozpoczęciem badania należy uwodnić wkład czujnika strumienia zewnątrzkomórkowego z kalibrem, dodając do płytki 150 μl roztworu kalibru strumienia zewnątrzkomórkowego i inkubując przez noc w temperaturze 37 °C bez CO2 .
- Za pomocą stacji myjki płytkowej zmień pożywkę do hodowli komórkowych na pożywkę do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego o pH 7,0. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C bez CO2 przez 30–60 minut.
- Przygotować roztwory robocze 8 μM oligomycyny, 4,5 μM 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu karbonilcyjanku (FCCP), 10 μM rotenonu i 10 μM antymycyny A w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Załadować 25 μl roztworów podstawowych do portów iniekcji wkładu: port A, oligomycyna; Port B, FCCP; Port C, rotenon i antymycyna A z pożywką do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego. Wdrożyć protokół oznaczania zgodnie z opisem w tabeli 1.
- Załaduj uwodniony wkład do bioanalizatora i przeprowadź kalibrację, klikając przycisk "Start". Po zakończeniu kalibracji zdejmij dolną płytę wkładu i załaduj płytkę ogniwa, klikając monit "Rozładuj wkład". Kontynuuj test, aż wszystkie pomiary zostaną zakończone.
- Otwórz plik danych i uzyskaj wartości szybkości z bioanalizatora. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego.
Tabela 1. Protokół uruchomienia instrumentu.
