Zapis aktywności nerwu doprowadzającego krezki w segmencie jejunum myszy ex vivo

Streszczenie

Źródło: Nullens, S., et al. In vitro Rejestracja aktywności nerwu aferentnego krezki w segmentach jejunalnych i okrężnicy myszy. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje proces rejestrowania sygnałów elektrycznych z krezkowych nerwów doprowadzających w wypreparowanym segmencie jelita czczego myszy w celu zbadania wpływu ciśnienia w tkance i zmian ruchu na aktywność nerwu doprowadzającego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie nerwu doprowadzającego do jelita czczego

1. Przeprowadzić eutanazję młodego lub dorosłego gryzonia na gryzoniach, która została zatwierdzona przed eksperymentem przez lokalną Komisję Etyczną (np. sedacja końcowa, a następnie punkcja serca, zwichnięcie szyjki macicy itp.).
   nuta: Użyliśmy zwichnięcia szyjki macicy do złożenia zwierząt w ofierze, co zaowocowało eksperymentami bez konieczności dalszego znieczulenia lub opieki pooperacyjnej, ponieważ tkanki są dalej przetwarzane in vitro.
   nuta: Wykazano, że wiek osłabia aferentne funkcje mechanosensoryczne krezki, dlatego zalecamy badaczom przestrzeganie określonej grupy wiekowej na czas trwania pojedynczego eksperymentu.
2. Umieścić ofiarowane zwierzę laboratoryjne w pozycji leżącej na plecach i wykonać nacięcie linii środkowej brzucha przez skórę i warstwę mięśni brzucha za pomocą skalpela, rozciągając się od wyrostka mieczykowatego aż do kości łonowej.
3. Kąpać jamę brzuszną zimnym roztworem Krebsa, aby zapobiec wysychaniu tkanek wewnątrz jamy brzusznej (skład Krebsa: 120,03 mM NaCl, 6,22 mM KCl, 1,57 mM NaH₂PO₄, 15,43 mM NaHCO₃, 1,21 mM MgSO₄, 11,52 mM D-glukoza i 1,52 mM CaCl₂).
4. Szybko wyciąć całe jelito czcze ostrymi nożyczkami, wycinając około 20 cm jelita cienkiego, zaczynając bezpośrednio dystalnie od zgięcia dwunastnicy, uważając, aby nie uszkodzić otaczających struktur i pozostawiając krezkę jelita, która zawiera naczynia krwionośne jelita czczego i nerwy doprowadzające, w stanie nienaruszonym.
   nuta: Do samego rozwarstwienia jelita czczego w jamie brzusznej nie trzeba używać mikroskopu stereoskopowego, ponieważ można to łatwo zobrazować gołym okiem.
5. Umieść wycięte jelito czcze w lodowatym roztworze Krebsa i trzymaj je na lodzie, stale natleniając roztwór Krebsa karbogenem (95%_O2, 5% CO₂).
6. Przetnij jelito czcze ostrymi nożyczkami w pętle o długości około 3 cm. Obserwuj pęczek krezkowy zawierający naczynia i nerw splanchniczny gdzieś w pobliżu środka odpowiedniej pętli.
7. Przepłukać każdy segment roztworem Krebsa za pomocą cewnika w celu usunięcia zawartości światła i treści pokarmowej, ponieważ zawierają one enzymy trawienne, które przyspieszą degradację próbki tkanki in vitro.
   nuta: Należy uważać, aby nie uszkodzić światła pętli podczas płukania, ponieważ zniszczenie kosmków spowoduje uwolnienie mediatorów, które mogą zmienić aktywność nerwu doprowadzającego.
8. Zidentyfikuj segment do pomiaru aktywności nerwu doprowadzającego (np. pierwszy odcinek jelita czczego dystalnie więzadła Treitza lub zgięcie dwunastnicy) i umieść go w specjalnie zbudowanej komorze zapisu pokrytej warstwą elastomeru silikonowego.
   nuta: Początek jelita czczego jest anatomicznie zdefiniowany jako część jelita cienkiego, w której więzadło Treitza przecina jelito cienkie, zwane również zgięciem dwunastnicy.
   nuta: Przykryj dno komory nagraniowej cienką warstwą elastomeru silikonowego na długo przed rozpoczęciem eksperymentu. Przygotuj tę warstwę elastomeru zgodnie z instrukcjami producenta.
9. Napełniać komorę w sposób ciągły ciepłym, karbogenowanym roztworem Krebsa z szybkością 10 ml/min i utrzymywać temperaturę Krebsa w komorze rejestracyjnej na stałym poziomie 34 °C.
10. Zamontuj segment jelita czczego w kąpieli narządowej tak, aby koniec ustny był połączony ze sterownikiem strzykawki zapewniającym przepływ światła, a koniec brzuszny łączył się z odpływem. Lekko rozciągnij segment, ale uważaj, aby nie wywierać nadmiernego napięcia. Przymocuj oba końce mocno za pomocą jedwabnych ligatur 4/0 do portów wlotowych i odpływowych.
11. Przymocuj strzykawkę do końcówki jamy ustnej i wykonaj śródświetlaną perfuzję odcinka jelita czczego roztworem Krebsa (nienatlenionym, o temperaturze otoczenia) z szybkością 10 ml/h.
12. Użyj szpilek do owadów, aby przypiąć krezkę zamontowanego odcinka jelitowego płasko do dolnej warstwy elastomeru silikonowego. Rozciągnij krezkę, aby zoptymalizować wizualizację pęczka krezkowego; Nie wywieraj nacisku na pęczek lub jelito czcze.
13. Wykonaj test rozdęcia rampy (vide infra), zamykając port wyjściowy, aż ciśnienie śródświetlne segmentu jelitowego osiągnie 60 mmHg, aby sprawdzić, czy z zamontowanego segmentu nie wycieka intraluminalny roztwór Krebsa. Obserwuj płynny wzrost ciśnienia śródświetlnego bez zakłóceń.
14. Obserwuj małe skurcze segmentu (fale perystaltyczne) podczas początkowej fazy rozdęcia. W razie potrzeby zablokować aktywność perystaltyczną, dodając 1 μM blokera kanału wapniowego typu L nifedypiny do roztworu Krebsa.
    nuta: Dodanie 1 μM atropiny do roztworu Krebsa wraz z nifedypiną całkowicie sparaliżuje odcinek jelitowy.
15. Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie zacznij odklejać tkankę tłuszczową z krezki, delikatnie szarpiąc ją dwiema małymi pęsetami, uważając, aby nie uszkodzić naczyń i nerwu doprowadzającego, które leżą zakopane w tkance tłuszczowej.
16. Zacznij w odległej odległości od jelita czczego i odsłoń oba naczynia krwionośne w pęczku krezkowym.
17. Obserwuj doprowadzający nerw jelita czczego pomiędzy obydwoma naczyniami jako cienką, białą nić otoczoną tkanką tłuszczową. Sekcję należy przeprowadzić bardziej proksymalnie w kierunku jelita czczego, delikatnie odrywając tkankę tłuszczową za pomocą pęsety, gdy początkowa identyfikacja zarówno naczyń krezkowych, jak i / lub nerwu doprowadzającego jest trudna.
18. Wypreparuj nerw krezkowy jelita czczego segmentu swobodnie na odległość kilku milimetrów, usuwając tkankę tłuszczową przylegającą do nerwu.
19. Przeciąć nerw za pomocą ostrych nożyczek do tkanek. W razie potrzeby oderwij pozostały tłuszcz i tkankę łączną, a także osłonkę epineuronalną, delikatnie pociągając ją małą pęsetą.
20. Za pomocą mikromanipulatora opuść końcówkę elektrody ssącej, połączonej ze strzykawką z tłokiem, do kąpieli narządowej; następnie, manipulując tłokiem, delikatnie zassać trochę roztworu Krebsa z kąpieli narządowej, tak aby końcówka elektrody została zanurzona w roztworze Krebsa (ryc. 1). Upewnij się, że roztwór Krebsa zakrywa drut elektrodowy wewnątrz elektrody ssącej.
    nuta: Użyj ściągacza do pipet, aby przygotować kapilarnę ssącą ze szkła borokrzemianowego zawierającą drut elektrodowy przed rozpoczęciem eksperymentu.
21. Umieść końcówkę elektrody ssącej bezpośrednio obok przeciętego pasma nerwowego doprowadzającego i wciągnij przecięte pasmo nerwowe do naczynia włosowatego na całej jego długości.
22. Skieruj końcówkę elektrody w kierunku tkanki tłuszczowej i zassaj ją do szklanej kapilary, jednocześnie mocno zasysając tłokiem, w ten sposób mechanicznie "uszczelniając" nerw w kapilarze od zawartości kąpieli narządowej.
23. Zweryfikuj zapis aktywności nerwów aferentnych za pomocą systemu akwizycji danych, np. wykonując wzrost wypalania aferentnego wywołany rozdęciem rampy (vide infra). Po wyizolowaniu nerwu do elektrody ssącej, przed wykonaniem właściwych eksperymentów należy ustabilizować preparat przez 15 minut, aby uzyskać stały stan spontanicznej aktywności nerwu doprowadzającego.
24. Aby wykonać rozdęcie rampy, należy rozciągnąć odcinek jelitowy, zamykając port wyjściowy, co prowadzi do stopniowego wzrostu ciśnienia (do 60 mmHg). Żądany protokół eksperymentalny należy przeprowadzić tylko wtedy, gdy trzy następujące po sobie rozciągnięcia rampy (w odstępie 15 minut) dają powtarzalne rozładowanie z wielu jednostek (rysunek 2).

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny przegląd specjalnie skonstruowanej komory rejestracyjnej i elektrody ssącej. Szczegółowy przegląd konfiguracji technicznej z elektrodą ssącą i komorą rejestracyjną na miejscu.

Rycina 2: Reprezentatywne śledzenie zapisu in vitro aktywno...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek sodu (NaCl)	Firma VWR Chemicals	2,78,10,295	złożony roztwór Krebsa
Chlorek potasu (KCl)	Acros organiczny	196770010	złożony roztwór Krebsa
Diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)	Firma VWR Chemicals	1,06,34,61,000	złożony roztwór Krebsa
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Merck	1,06,32,91,000	złożony roztwór Krebsa
Siarczan magnezu (MgSO4)	Merck	1,05,88,61,000	złożony roztwór Krebsa
Chlorek wapnia (CaCl2)	Merck	2,38,11,000	złożony roztwór Krebsa
D-glukoza	Firma VWR Chemicals	1011175P	złożony roztwór Krebsa
woda destylowana			złożony roztwór Krebsa
Rury PVC	Zaopatrzenie laboratoriów naukowych		Odcinek jelitowy powinien być zamontowany na rurkach PVC
Rurki silikonowe	Zaopatrzenie laboratoriów naukowych		Reszta rurki, najlepiej na bazie silikonu - łatwiej usuwa zanieczyszczenia z rurki
Nić jedwabna	Pearsall Sp. z o.o.	Numer katalogowy: 10B15S220	Mocowanie segmentu nad rurką PVC
Sterownik strzykawki	Aparatura Harvarda	Nr kat. 55-2222	Wlew doświetlny Krebsa
Lornetka - w tym 10-krotne powiększenie w okulonie	Zeiss STEMI 2000		Optymalna wizualizacja do rozwarstwienia nerwu doprowadzającego
Jednostka sterująca kocem homeotermicznym	Aparatura Harvarda	507214	Ogrzewanie komory organowej
Wykonana na zamówienie łaźnia organowa z dnem pokrytym Sylgardem
Oprogramowanie Spike2			Rejestrowanie i analiza danych
Szpilki do owadów, 500 sztuk, stal nierdzewna, średnica 0,2 mm	Szpilki do owadów Austerlitz minüdniens		Rozwarstwienie nerwu doprowadzającego
Pęseta Dumont #5 inox 11cm	Światowy instrument precyzyjny	500341	Rozwarstwienie nerwu doprowadzającego
Nożyczki, sprężynowe, 14 cm	Światowy instrument precyzyjny	Numer katalogowy: 15905	Rozwarstwienie nerwu doprowadzającego
Digitimer DB	NL 108T2/10		przetwornik ciśnienia
Mikromanipulator	Narishige powiedział:	Zobacz materiał M-3333	Manipulacja 3D elektrodą ssącą
Mikromanipulator	Blok obrotowy X-4		Manipulacja 3D elektrodą ssącą
Mikromanipulator	Stojak magnetyczny GJ-8		Manipulacja 3D elektrodą ssącą
Źródło światła	Mikroskopy Euromex Holandia EK-1		Optymalna wizualizacja do rozwarstwienia nerwu doprowadzającego
Aparatura rejestrująca CED 1401			Rejestracja aktywności nerwów doprowadzających
Eliminator szumów Humbug 50/60Hz	Instrumenty naukowe Quest		Eliminacja szumów tła
Pompa infuzyjna	Gibson Minipuls 2		Wlew z komory narządowej, w której zamontowany jest segment
Uchwyt mikroelektrody półogniwa 1,5 mm	Światowy instrument precyzyjny	MEH2SW	Elektroda ssąca do izolacji włókna doprowadzającego
Kapilary ze szkła borokrzemianowego, 300 szt.; 1.5/0.84 OD/ID	Światowy instrument precyzyjny	pozycji 1B150-4	Kapilar do izolacji nerwu doprowadzającego

powiedział: