Ustanowienie klamry krosowej dla całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z neuronów czuciowych lemieszowo-nosowych

Streszczenie

Źródło: Ackels, T., et al. Dogłębna analiza fizjologiczna zdefiniowanych populacji komórek w ostrych wycinkach tkanki narządu lemieszowo-nosowego myszy. J. Vis. Exp. (2016)

Wideo z protokołem opisuje tworzenie klamry do rejestracji elektrofizjologicznej z całych komórek z neuronów czuciowych narządu lemieszowo-nosowego (VNO) u myszy. Koronalny wycinek VNO z fluorescencyjnie znakowanymi neuronami czuciowymi umieszcza się w konfiguracji rejestracyjnej. Znakowany neuron jest łatany pipetą rejestrującą w konfiguracji całej komórki w celu zapisu elektrofizjologicznego w odpowiedzi na bodźce chemiczne.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy S₁: 4-(2-hydroksy-etylo)piperazyno-1-etanosulfonowy roztwór (HEPES) buforowany roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający (w mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES; pH = 7,3 (skorygowane NaOH); osmolarność = 300 mOsm (skorygowana glukozą).
2. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy S₂: Natleniony karbogenem (95%_O2, 5% CO₂) roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający (w mM) 125 NaCl, 25 NaHCO_3,5 KCl, 1 CaCl_{2,1 MgSO4,5} kwas bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowy (BES); pH = 7,3; osmolarność = 300 mOsm (skorygowana glukozą).
3. Przygotować 4% roztwór agarozy o niskiej temperaturze żelowania (S₃) do zatapiania w tkankach: 4% agaroza o niskiej temperaturze żelowania. Rozpuścić 2 g agarozy o niskiej żelacji w 50 ml S₁ w szklanej butelce laboratoryjnej o pojemności 100 ml razem z mieszadłem magnetycznym. Aby stopić agarozę, należy umieścić butelkę w łaźni wodnej (z nieszczelnie zamkniętą pokrywką) w temperaturze 70 °C na około 20 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się przezroczysty, mieszając. Ostudzić i przechowywać rozpuszczoną agarozę w drugiej łaźni wodnej w temperaturze 42 °C do czasu dalszego użycia.
4. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy S₄: Roztwór pipetowany zawierający (w mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 glikol etylenowy, kwas tetraoctowy (EGTA), 0,3 CaCl₂ (wolny^Ca2+ = 110 nM), 10 HEPES, sól magnezowa 2-adenozyno-5′-trifosforanu (MgATP), 1 sól sodowa 5′-trifosforanu guanozyny (NaGTP); pH = 7,1 (skorygowane KOH); osmolarność = 290 mOsm.
5. Modyfikować/dostosowywać skład S₁, S₂ i S₄ zgodnie z indywidualnym planem doświadczalnym (np. blokery farmakologiczne w celu wyizolowania niektórych rodzajów prądów aktywowanych napięciem).

2. Sekcja VNO i osadzanie

1. Uśmierc zwierzę przez krótką ekspozycję na CO₂ i odetnij głowę ostrymi nożyczkami chirurgicznymi. Uwaga: Ponieważ czas od złożenia zwierzęcia w ofierze do umieszczenia kapsuły VNO na lodzie jest krytyczny, należy zminimalizować czas do mniej niż 2 minut. Aby utrzymać żywotność tkanek, należy zanurzyć oba w pełni wypreparowane VNO w agarozie w czasie krótszym niż 30 minut.
2. Usuń dolną szczękę dużymi nożyczkami chirurgicznymi. Wejdź przez jamę ustną i przetnij osobno kości żuchwy i mięśnie z każdej strony.
3. Pozostałą część głowy umieść do góry nogami na dużej szalce Petriego.
4. Odciągnij skórę górnej szczęki i wokół czubka nosa średnimi kleszczami, aby uzyskać lepszy dostęp do siekaczy.
5. Użyj nożyczek do kości, aby odciąć największą część siekaczy pod kątem ~45° w kierunku rostralnym (ryc. 1A). Ułatwi to wyjęcie kapsułki VNO z jamy nosowej.
   nuta: Nie ciąć do korzenia zęba, aby zapobiec uszkodzeniu końcówki kapsułki VNO.
6. Chwyć sztywne górne podniebienie za jego rostralną część za pomocą średnich kleszczy i ostrożnie oderwij z powrotem w jednym kawałku pod płaskim kątem (ryc. 1B).
   nuta: Kilkakrotnie spłucz lodowatym S₂.
7. Użyj nożyczek z mikrosprężyną, aby przeciąć zespolenie kostne między czubkiem kości lemieszowej a szczęką. Włóż końcówki nożyczek tak, aby zakrzywiona część końcówki była skierowana na zewnątrz od VNO i ostrożnie przeciąć kość małymi krokami zarówno po lewej, jak i prawej stronie po stronie kapsuły VNO.
8. Aby usunąć kapsułkę VNO, za pomocą mikronożyczek sprężynowych przeciąć kość lemieszową w części ogonowej i ostrożnie wyjąć kość lemieszową z jamy nosowej za pomocą średnich kleszczy. Natychmiast przenieś VNO na małą szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym na opakowaniu z żelu lodowego, gdzie zostaną wykonane pozostałe etapy sekcji.
9. Opłucz VNO w niewielkiej ilości lodowatego S₂, aby zapobiec wyschnięciu chusteczki.
10. Oddziel chrzęstne kapsułki, które zawierają tkanki miękkie VNO, chwytając tylną część kości lemieszowej średnimi kleszczami. Ustaw kapsułę tak, aby uzyskać widok grzbietowy, tak aby widoczna była przerwa między oboma VNO (Rysunek 1D_i).
11. Użyj końcówki cienkich kleszczy, aby oddzielić obie chrzęstne kapsułki VNO od kości środkowej, jednocześnie utrzymując kość lemieszową przygwożdżoną w tylnej części.
    nuta: Używaj kleszczy tylko na brzegu torebki chrzęstnej i bardzo uważaj, aby nie przebić chrząstki, ponieważ delikatny nabłonek czuciowy łatwo ulega uszkodzeniu.
12. Po rozdzieleniu dwóch VNO zacznij usuwać chrząstkę otaczającą pierwszy VNO.
13. Chwyć górną krawędź kapsułki jednym cienkim kleszkiem i odłup ścianę chrząstki, która wcześniej była przymocowana do kości lemieszowej (strona przyśrodkowa).
14. Aby usunąć pozostałą chrząstkę, obróć VNO zakrzywioną boczną stroną do dna naczynia i bezpiecznie przyciśnij chrząstkę z jednej strony za pomocą kleszczy. Ostrożnie przesuń drugie cienkie kleszcze od tyłu pod bardzo płaskim kątem między chrząstką a VNO, aby poluzować połączenie między tkanką a chrząstką.
15. Powoli odklej VNO od chrząstki, trzymając ją za końcówkę ogonową, aby uniknąć uszkodzenia nabłonka czuciowego.
16. Po wyjęciu VNO z kapsułki należy usunąć wszystkie pozostałe małe części chrząstki, ponieważ wszelkie pozostałe kawałki chrząstki oderwą tkankę od otaczającej agarozy podczas procesu krojenia.
17. Umieść małą kroplę lodowatego S₂ na pierwszym wypreparowanym VNO, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki. Duże naczynie krwionośne po bocznej stronie stanie się widoczne, co wskazuje, że narząd jest nadal nienaruszony i nie został poważnie uszkodzony podczas sekcji (ryc. 2A_ii). W przypadku, gdy naczynie krwionośne zostanie uszkodzone, nadal warto będzie kontynuować krojenie VNO, o ile ogólna morfologia nie została wyraźnie naruszona.
18. Natychmiast przeanalizuj drugi VNO.
19. Aby osadzić VNO, należy napełnić obie małe szalki Petriego aż do brzegu stopionym S₃ (przechowywanym w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C; patrz 1.3).
20. Przytrzymaj VNO na szerszym końcu ogonowym za pomocą cienkich kleszczy, aby uniknąć uszkodzenia nabłonka czuciowego.
21. Zanurz VNO w agarozie i kilkakrotnie przesuń go poziomo do przodu iz powrotem, aby usunąć film roztworu zewnątrzkomórkowego, a także wszelkie pęcherzyki powietrza z jego powierzchni.
22. Ustaw VNO pionowo z końcówką ogonową skierowaną w stronę dna naczynia. Zamiast ściskać VNO bezpośrednio kleszczami, dostosuj orientację, przesuwając końcówkę kleszczy w bliskiej odległości od VNO.
    nuta: Orientacja podczas osadzania jest kluczowa, ponieważ określa płaszczyznę przekroju i dostępność dla neuronów czuciowych podczas eksperymentu.
23. Umieść naczynia na żelowym woreczku z lodu i poczekaj, aż agaroza stężeje.
    Uwaga: Nie zmieniaj orientacji VNO, gdy agaroza zacznie krzepnąć, ponieważ spowoduje to oderwanie tkanki od otaczającej agarozy.

3. Krojenie tkanek koronalnych VNO

1. Użyj małej szpatułki, aby usunąć blok agarozy z małego naczynia do pokrywki dużej szalki Petriego, odwróć agarozę do góry nogami, pozostawiając ogonowy koniec VNO skierowany do góry.
2. Pokrój blok w kształt piramidy za pomocą skalpela chirurgicznego (3-4 mm na końcu, 8-10 mm na dole). Uważaj, aby nie uszkodzić osadzonej tkanki.
3. Użyj super kleju, aby przymocować blok w kształcie piramidy do środka płytki próbki wibratomu i poczekaj ~ 1 minutę, aż klej całkowicie wyschnie.
4. Przenieść płytkę z próbką do komory krojenia i odpowiednio przygotować drugi VNO. Przechowywać płytkę z drugą próbką w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
5. Użyj mikrotomu z wibrującymi ostrzami o następujących ustawieniach: grubość: 150-200 μm; prędkość: 3,5 a.u. = 0,15 mm/s; częstotliwość: 7,5 a.u. = 75 Hz. Przenieś plastry do komory natleniającej do czasu użycia po krótkim sprawdzeniu morfologii plastrów pod mikroskopem preparacyjnym. Plastry można przechowywać przez kilka godzin.

4. Jednokomórkowe zapisy elektrofizjologiczne

1. Do nagrań należy używać pionowego mikroskopu stałopozycyjnego wyposażonego w obiektywy zanurzeniowe w wodzie, Dodt lub kontrast różnicowy w podczerwieni (IR-DIC) i epifluorescencję, a także chłodzoną kamerę z urządzeniem ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Do akwizycji danych należy użyć wzmacniacza patch-clamp, stopnia głównego, karty interfejsu analogowo-cyfrowego / cyfrowo-analogowego (AD/DA) oraz komputera (w tym oprogramowania do nagrywania).
2. Przygotuj zapas 10-20 pipet z wsadkami (4-7 MΩ). Wyciągnąć pipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,50 mm [OD]/średnica wewnętrzna 0,86 mm [ID]) za pomocą ściągacza do mikropipet i wypolerować ogniowo za pomocą mikrokuźni.
   nuta: Polerowanie ogniowe końcówek pipet ma kluczowe znaczenie podczas łatania raczej małych VSN. Pomoże to zapobiec pękaniu błony komórkowej podczas stosowania podciśnienia w celu uzyskania uszczelnienia o wysokiej wytrzymałości. Po wypolerowaniu otwór pipety powinien wynosić około 1 μm.
3. Pipety należy przechowywać w pojemniku do przechowywania pipet, aby zapobiec uszkodzeniom i gromadzeniu się kurzu do czasu użycia.
4. Przygotuj system perfuzyjny, napełniając zbiorniki roztworu i rurki zgodnie z projektem eksperymentalnym.
   nuta: Całkowicie usuń pęcherzyki powietrza z przewodów, ponieważ będą one silnie zakłócać zapisy elektrofizjologiczne.
5. Dostosuj ciśnienie, aby osiągnąć przepływ ~3 ml / min.
   nuta: Wysokie ciśnienie spowoduje przemieszczenie się wycinka tkanki, a także zakończenie zapisów elektrofizjologicznych.
6. Przenieś plasterek VNO do komory obrazowania i ustal pozycję plastra za pomocą kotwy ze stali nierdzewnej okablowanej włóknami syntetycznymi o grubości 0,1 mm (Rysunek 2B-C).
   nuta: Nie przykrywaj plastra tkanki jedną z nici z włókien syntetycznych, ale raczej agarozą otaczającą plasterek.
7. Przenieś komorę obrazowania do zestawu rejestrującego i w sposób ciągły przetapiaj plaster z natlenionym S₂ w temperaturze pokojowej za pomocą aplikacji kąpielowej.
8. Dopasuj kapilę ssącą do powierzchni roztworu, aby uzyskać powolne ssanie w celu ciągłej wymiany roztworu kąpieli. Wyreguluj wielolufowy "ołówek perfuzyjny" 8 w 1 powyżej i blisko nieczuciowej części wycinka VNO, który zawiera naczynie krwionośne (Rysunek 2C, 3A). Korzystne będzie ustawienie ołówka perfuzyjnego i pipety rejestrującej tak, aby były skierowane w stronę plasterka z przeciwnych kierunków.
9. Połączyć elektrodę referencyjną i roztwór do kąpieli za pomocą mostka agarowego w kształcie litery L (wypełnionego 150 mM KCl).
10. Napełnij pipetę z plastrem roztworem pipety S₄.
11. Zamontuj pipetę na elektrodzie krosowej pokrytej chlorkiem srebra podłączonej do stopnia głowicy bez zeskrobywania powłoki i mocno zamocuj.
12. Przed wejściem do kąpieli należy zastosować lekkie nadciśnienie (około 1 ml na plastikowej strzykawce o pojemności 10 ml) w pipecie z plastrem.
13. Opuść pipetę do kąpieli za pomocą mikromanipulatorów na tyle daleko, aby móc zanurzyć obiektyw bez uderzania w niego (Rysunek 2D).
14. Monitorowanie rezystancji pipet (_R, w zakresie 4-7 MΩ) za pomocą oprogramowania do elektrofizjologii podłączonego do stopnia głowicy.
    nuta: Jeśli_R wynosi <4 MΩ, szklana końcówka jest pęknięta. Jeśli R wynosi >10 MΩ, końcówka jest najprawdopodobniej zatkana i pipetę należy wymienić.
15. Wizualizuj wycinek VNO za pomocą kamery CCD przy użyciu zoptymalizowanego pod kątem podczerwieni różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i zidentyfikuj komórki eksprymujące FPR-rs3-i-Venus (FPR-rs3: sekwencja 3 związana z receptorem peptydu formylowego) (lub podobnie oznakowane neurony) za pomocą oświetlenia fluorescencyjnego i odpowiedniej kostki filtrującej.
16. Skoncentruj się i celuj w ogniwa fluorescencyjne lub niefluorescencyjne w zależności od projektu eksperymentalnego.
17. Aby zbliżyć się do korpusu komórki, użyj pokręteł ręcznych, aby uzyskać maksymalną czułość. Ze względu na nadciśnienie niewielkie wgniecenie w błonie soma komórkowej staje się widoczne, gdy końcówka pipety znajdzie się w bliskiej odległości.
18. Zwolnij nadciśnienie i zastosuj lekkie podciśnienie, aby zassać błonę komórkową w celu uzyskania uszczelnienia o wysokiej rezystancji (1-20 GΩ). Zastosuj krótkie i delikatne ssanie, aby przerwać błonę komórkową i ustalić konfigurację całej komórki.
19. Stale monitoruj opór dostępu podczas eksperymentu.
    nuta: Do analizy należy uwzględnić tylko neurony wykazujące małą i stabilną rezystancję dostępu (≤3%_{danych wejściowych} R; zmiana <20% w trakcie eksperymentu).

Wyniki

Rysunek 1: Sekcja VNO. (A) Widok z boku na głowę myszy w celu zilustrowania pozycji i kąta, pod jakim siekacze są przecięte. (B) Widok brzuszny przedstawiający najlepszy punkt do chwycenia i odklejenia górnego podniebienia (UP). (C) Widok brzuszny na torebkę chrzęstną (CC), w której znajduje się VNO i kość lemieszowa (VB) po usunięciu dolnej szczęki...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
chemikalia
Agaroza (niska temperatura żelowania)	PeqLab	35-2030
ATP (Mg-ATP)	Sigma-Aldrich	A9187
Kwas bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowy (BES)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał B9879
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1016
Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
glukoza	Sigma-Aldrich	Kontroler G8270
GTP (Na-GTP)	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 51120
Kwas (2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M8266
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9333
Wodorotlenek potasu	Sigma-Aldrich	3564
chlorek sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7653
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S5761
wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S8045
Narzędzia chirurgiczne i materiały eksploatacyjne
Duża szalka Petriego, 90 mm	Firma VWR		dekapitacja, sekcja kapsuły VNO
Mała szalka Petriego, 35 mm	Firma VWR		pokrywka do rozwarstwienia VNO, naczynie do zatapiania w agarozie
Ostre duże nożyczki chirurgiczne	Narzędzia naukowe		dekapitacja, usunięcie żuchwy
Mocne nożyczki do kości	Narzędzia naukowe		siekacze tnące
Kleszcze średnie, pęseta Dumont #2	Narzędzia naukowe		usuwanie skóry i podniebienia
Nożyczki mikrosprężynowe, 8,5 cm, zakrzywione, ostrza 7 mm	Narzędzia naukowe		wycinanie VNO
Dwie pary cienkich kleszczy, pęseta Dumont #5	Narzędzia naukowe		wypreparowanie VNO z torebki chrzęstnej
Mała szpatułka ze stali nierdzewnej	Narzędzia naukowe		Manipulowanie blokami agarozy i plastrami tkanek
Skalpel chirurgiczny			Cięcie bloku agarozy w kształt piramidy
sprzęt
wzmacniacz	HEKA Elektronik	Zobacz materiał EPC-10
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (1,50 mm OD/0,86 mm ID)	Produkty naukowe
Kamera CCD	Mikrosystemy Leica	DFC360FX
Kostka filtracyjna, wzbudzenie: BP 450-490, tłumienie: LP 515	Mikrosystemy Leica	Silnik I3
Lampa fluorescencyjna	Mikrosystemy Leica	EL6000
Mieszadło magnetyczne z płytą grzejną	Snijders powiedział:	Numer telefonu 34532
Mikrokuźnia	Narishige powiedział:	MF-830
Urządzenie mikromanipulacyjne	Luigs & Neumann	Zobacz materiał SM-5
Ściągacz do mikropipet, pionowy, dwustopniowy	Narishige powiedział:	Komputer PC-10
mikroskop	Mikrosystemy Leica	CSM DM 6000 SP5
Eliminator szumów 50/60 Hz (HumBug)	Zadanie naukowe
cel	Mikrosystemy Leica	HCX APO L20x/1,00 W
Oscyloskop	Tektronik	TDS 1001B
Osmometr	Gonotec	Osmomat 030
System perfuzyjny 8 w 1	AutoMate Scientific
pH-metr pięć łatwych	METTLER TOLEDO
Słoik do przechowywania pipet	Światowe instrumenty precyzyjne	E212
Komora nagraniowa	Luigs & Neumann	Mini komora Slice
Żyletki	Wilkinson Sword GmbH	Klasyczny miecz Wilkinsona
Komora do przechowywania plastrów natleniających; alternatywnymi komorami komercyjnymi są np. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) lub Komora wstępna (BSC-PC; Warner Instruments)	Zamówienie
Mikroskop stereoskopowy	Mikrosystemy Leica	S4E
Interfejs spustu	HEKA Elektronik	TIB-14 S
Wibratomizm	Mikrosystemy Leica	VT 1000 S
Kąpiel wodna	Memmert	WNB 45