Monitorowanie kory mózgowej za pomocą układu wieloelektrodowego w odpowiedzi na czynniki wywołujące napady

Streszczenie

Źródło: Lu, H. C., et al. Stymulacja prądem stałym i zapis wieloelektrodowy aktywności podobnej do napadu w przygotowaniu wycinków mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016).

W tym filmie badane są efekty przezczaszkowej stymulacji prądem stałym (tDCS) na wycinki mózgu zawierające przednią korę obręczy (ACC) i obszary wzgórza, używając matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru sygnałów elektrycznych. Dostarczając impulsy elektryczne i podając leki wywołujące napady, badanie bada odpowiedź ACC na napady.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie eksperymentalnego roztworu i sprzętu do nagrywania MEA (Multielectrode Array)

1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF; 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₃, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO₃ i 10 mM glukozy, pęcherzykowy z 95% O₂ i 5% CO_{2 ).}
2. Użyj dwóch typów sond MEA: 6 x 10 płaskich MEA i 8 x 8 MEA. Pierwsza sonda obejmuje obszar obejmujący korę, prążkowie i wzgórze. Ta ostatnia sonda obejmuje tylko obszar korowy.
3. Użyj 60-kanałowego wzmacniacza z filtrem pasmowo-przepustowym ustawionym w zakresie od 0,1 Hz do 3 kHz przy 1,200 amplifikacji. Pobieraj dane z częstotliwością próbkowania 10 kHz.
4. Umieść dwa srebrne druty pokryte AgCl w komorze MEA w celu stymulacji prądem stałym (DCS). Następnie użyj srebrnych drutów pokrytych AgCl do wytworzenia pól elektrycznych generowanych przez izolowany stymulator.
5. Umieść elektrodę wolframową (średnica, 127 μm; długość, 7,62 cm; końcówka stożkowa 8° AC; rezystancja, 5 MΩ) do stymulacji wzgórza i umieść elektrodę odniesienia w komorze MEA. Dostarczyć prądy elektrody wolframowej za pomocą izolowanego stymulatora, który jest sterowany przez generator impulsów (rysunek 1).

2. Przygotowanie plastra mózgu

1. Użyj samców myszy C57BL/6J w wieku 4-8 tygodni. Trzymanie zwierząt w klimatyzowanym pomieszczeniu (21-23 °C; 50% wilgotności; 12 godzin/12 godzin cyklu światła/ciemności, światło włącza się o 8:00) z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody.
2. Pobrać 250 ml porcji płynu CSF przygotowanego w kroku 1.1 i umieścić go w zlewce wypełnionej lodem. Jednocześnie dostarczaj ciągły gaz składający się w 95% z_O2 i 5%_CO2
.
3. chirurgia
   1. Znieczulić zwierzę 4% izofluranem w szklanym pudełku przez około 3 minuty. Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną głębokość znieczulenia (na co wskazuje brak reakcji na uszczypnięcie palca), umieść je na płytkiej tacy wypełnionej pokruszonym lodem i usuń głowę nożyczkami.
   2. Odsłoń czaszkę i odetnij pozostały mięsień. Następnie, za pomocą rongeurs, oderwij grzbietową powierzchnię czaszki od mózgu. Odetnij boki czaszki za pomocą rongeurs. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 75% roztworem etanolu.
   3. Za pomocą szpatułki przetnij opuszki węchowe i połączenia nerwowe wzdłuż brzusznej powierzchni mózgu i usuń mózg. Po dekapitacji i szybko przenieś mózg do zlewki wypełnionej lodowato natlenionym aCSF.
4. Przygotowanie wzgórza przyśrodkowego (MT)-ACC (przednia kora obręczy) Brain Slice
   nuta: Przygotowanie wycinków zawierających ścieżkę od MT do ACC
   1. Ręcznie wytnij blok mózgu za pomocą dwóch strzałkowych nacięć 2,0 mm bocznych do linii środkowej w każdej półkuli, aby wyświetlić anatomię podkorową. Następnie wykonaj dwa cięcia pod kątem. Wykonaj pierwsze cięcie poprzeczne równolegle do widocznego przewodu światłowodowego w prążkowiu.
   2. Wykonaj drugi przekrój poprzeczny od połączenia między móżdżkiem a korą wzrokową do punktu środkowego między spoidłem przednim a drogami wzrokowymi, które są brzuszne i równoległe do szlaku wzgórzowo-obręczowego.
   3. Przymocuj blok mózgu do kątowej płytki (~120°) za pomocą kleju cyjanoakrylowego i wykonaj nacięcie tuż nad punktem zwrotnym ścieżki. Rozłóż płytkę, spłaszcz ją i przyklej do stopnia komorowego wibratomu.
   4. Przygotować przyśrodkowe plastry mózgu wzgórza-ACC (o grubości 500 μm), a następnie zanurzyć je w lodowato natlenionym aCSF. Przenieść plastry do komory rejestracyjnej i utrzymywać w temperaturze 32 °C pod ciągłą perfuzją (12 ml/min) z natlenionym aCSF przez 1 godzinę.

3. Przygotowanie komory perfuzyjnej do zapisu w matrycy wieloelektrodowej

1. Przygotowanie komory perfuzyjnej
   1. Umieść sondę MEA w systemie wielokanałowym i użyj dwóch oddzielnych rurek polietylenowych, aby podłączyć sondę do pompy perystaltycznej. Użyj jednej rurki do wprowadzenia aCSF do komory MEA, a drugiej rurki do wyprowadzenia aCSF z komory. Na koniec należy w sposób ciągły perfekować preparat ciepłym (29-30 °C) natlenionym aCSF (8 ml/min).
2. Przenieś wycinek mózgu do MEA. Przytrzymaj plasterek mózgu na MEA za pomocą mokrego bawełnianego wacika. Ostrożnie przesuń wycinek mózgu, aby upewnić się, że ACC jest zorientowany nad elektrodami.
3. Użyj zestawów kotew do krojenia i przytrzymywania plasterków, aby docisnąć plasterek mózgu. Ten krok zapewnia dobre połączenie elektryczne między plastrem a elektrodami.

4. Generowanie pól elektrycznych przez DCS

Uwaga: Definicja orientacji pola elektrycznego opierała się na kierunku osi akkodendrytycznej w ACC. Orientacje przedziałów dendrytowych i soma potwierdzono za pomocą barwienia metodą Golgiego12.

1. Umieść elektrodę AgCl (zdefiniowaną jako anodę) proksymalnie do ACC i umieść drugą elektrodę (zdefiniowaną jako katoda) dystalnie do ACC. Zapisz natężenie pola, które jest generowane przez dwie orientacje pola (równoległe i prostopadłe do włókien akkodendrytycznych ACC) przez MEA i dostarczaj prądy pól elektrycznych za pomocą stymulatora.
2. Ustal odległość elektrod AgCl (około 1,5-2 cm) i dostosuj natężenie prądu stymulatora, aby DCS wynosił od 0,5 do 2 mA.

5. Elektrycznie indukowane korowe reakcje synaptyczne

Uwaga: Wywołanie reakcji synaptycznych w ACC poprzez stymulację elektryczną w MT, w której programowalny generator bodźców elektrycznych wytwarza prostokątne dwufazowe impulsy prądu.

1. Powtórz sekcję 3 powyżej.
2. Umieść elektrodę wolframową w MT i dostarczaj impulsy ze stymulatora do obszaru wzgórza plastrów za pomocą bipolarnych elektrod wolframowych.
3. Użyj różnych natężeń prądu, aby określić próg, który wywołuje odpowiedź ACC. W tym przypadku użyj intensywności ±150 μA i czasu trwania 200 μs, co wywołało 80% maksymalną odpowiedź w ACC w większości plasterków.
4. Przesunąć elektrodę wolframową wzdłuż szlaku wzgórza (od MT do ciała modzelowatego) w warstwie MT-ACC, aby uzyskać optymalne profile odpowiedzi.
5. Wykonaj 10-20 przeciągnięć odpowiedzi ACC i użyj oprogramowania, aby automatycznie uśrednić wszystkie ACC wywołane stymulacją MT. Wynikiem są odpowiedzi synaptyczne w ACC indukowane przez stymulację MT przez szlak MT-ACC.

6. Aktywność podobna do napadu elektrycznego

Uwaga: Aktywność podobna do napadu została wywołana przez zastosowanie 4-aminopirydyny (4-AP; 250 μM) i bicukuliny (5 μM). Wcześniejsze badania czasowo-kontrolne wykazały, że maksymalne i stabilne odpowiedzi pojawiały się 2-3 godziny po zastosowaniu leku14.

1. Powtórz sekcję 5 powyżej.
2. Dodaj leki do roztworu perfuzyjnego. Użyj 4-AP (4-aminopirydyna) (250 μM) i bicukuliny (5 μM). Równomiernie wymieszać leki i kontynuować perfuzję przez 2-3 godziny.
3. Aby ułatwić aktywność podobną do napadów padaczkowych, utrzymuj pompę perfuzyjną na stosunkowo szybkim tempie perfuzji (8 ml/min), co może również pomóc w zapobieganiu gromadzeniu się gradientu pH.
4. Umieść elektrodę wolframową w MT i dostarcz stymulację elektryczną (150 μA, czas trwania 200 μs), aby uzyskać profile odpowiedzi ACC.
5. Wykonaj 10-20 przeciągnięć i uśrednij odpowiedzi.
6. Zastąp roztwór perfuzyjny świeżym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby wypłukać leki. Powtórz krok 6.5.

Wyniki

Rysunek 1: Przygotowanie plastra talamocingulate i konfiguracji systemu rejestracji MEA. (a) Procedura plastrów MT-ACC (a) Usunąć mózg i (b) przenieść do chłodnego natlenionego aCSF. (c) Wykonaj dwa cięcia przystrzałkowe od linii środkowej. (d) Widok z boku na przyśrodkową część bloku mózgowego. (e) Wykonaj dwa ukośne brzuszne nacięcia bloku mózgu. (f) Przyklej blok mózgowy do ustawionej pod kątem p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Izofluran	Korporacja Produktów Halowęglowych	NDC 12164-002-25	4 proc
aCSF (całkowita:1 L):
D(+)-Glukoza	Merck	1.08337.1000	10 mM
Wodorowęglan sodu	Merck	1.06329.0500	25 mM
chlorek sodu	Merck	Numer katalogowy: 1.06404.1000	124 mM
(+)-L-askorbinian sodu, >=98%	Sigma	A4034-100G	0,15 g/2 c.c
Siarczan magnezu, bezwodny, ReagentPlus	Sigma	Zobacz materiał M7506-500G	2 mM
Chlorek wapnia dwuwodny	Merck	1.02382.1000	2 mM
Diwodorofosforan sodu jednowodny	Merck	1.06346.1000	1 mM
Chlorek potasu	May & Baker Ltd Dagenham, Anglia	Zobacz materiał MS 7616	4,4 mln
(+)-Bicuculline	TOCRIS	130	5 μM w aCSF
4-aminopirydyna	TOCRIS	940	250 μM w CSF
Wibratomizm	Wibratomizm	Seria 1000	Krojenie bloków na plastry o grubości 500 μm
Sondy wieloelektrodowe (MEA): 6 x 10 płaskie MEA	Systemy wielokanałowe	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	średnica elektrody, 30 μm; rozstaw elektrod, 500 μm; impedancja, 50 kΩ przy 200 Hz
Sondy wieloelektrodowe (MEA): 8 x 8 MEA	Ayanda Biosystems	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	elektroda piramidalna; średnica, 40 μm; wysokość końcówki, 50 μm; rozstaw elektrod: 200 μm; impedancja, 1 000 kΩ przy 200 Hz
Zastosowano 60-kanałowy wzmacniacz z filtrem pasmowo-przepustowym ustawionym w zakresie od 0,1 Hz do 3 kHz przy 1200-krotnym wzmocnieniu	Systemy wielokanałowe	MEA-1060-BC
Oprogramowanie MC Rack z częstotliwością próbkowania 10 KHz	Systemy wielokanałowe		Oprogramowanie do zbierania i rejestrowania danych
sterowanie generatorem impulsów	Systemy wielokanałowe	Zobacz materiał STG 1002
Zestawy kotwiące i dociski Slice	Instrumenty Warnera	SHD-26H/10; WI64-0250
Pompa perystaltyczna-minipuls3	Gilsom powiedział:	MINIPULS3	Szybkość perfuzji: 8 ml/min
Izolowany stymulator	Systemy A-M	nr wzoru 2100	natężenie ±350 μA, czas trwania 200 μsec
Elektroda	Systemy A-M	Numer katalogowy: 575300	umieszczony we wzgórzu

. TGL szt. szt. powiedział: