Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Leki na mikrojonoforezę
UWAGA: Leki używane do mikrojonoforezy muszą mieć ładunek elektryczny po rozpuszczeniu w wodzie. Należy zapoznać się z literaturą, aby sprawdzić, czy lek, który Cię interesuje, jest odpowiedni do tej procedury. Tutaj opisano procedurę dla gabazyny, antagonisty receptora GABAA.
- Przefiltruj wodę destylowaną za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm, aby ją wysterylizować i upewnić się, że nie zawiera substancji rozpuszczonych. Używając tej wody destylowanej, przygotuj ~1,000 μl 20 mM gabazyny.
- Dostosować pH rozcieńczenia do 4 za pomocą 0,2 μm przefiltrowanego NaOH za pomocą elektrody pH z cienką końcówką.
- Przechowywać 100 - 200 μl porcji w temperaturze -20 ºC. Rozmrozić w dniu nagrania. Tego dnia, zanim zwierzę zostanie skrępowane, napełnij beczki (3 - 5 μl) elektrody wielolufowej lekami, używając mikrostrzykawki o pojemności 100 μl wyposażonej w elastyczną igłę z tworzywa sztucznego.
2. Chirurgia i implantacja głowy
- Przeprowadzić eksperymenty na dwóch samcach myszy CBA/J (Mus musculus) o masie 27 i 30 g.
- W dniach poprzedzających operację należy obchodzić się ze zwierzętami i pozwolić im swobodnie eksplorować komorę rejestracyjną, aby je do niej przyzwyczaić. Wykonuj trzy sesje dziennie, z których każda trwa co najmniej 30 minut. To ich uspokoi i sprawi, że będą się komfortowo czuć podczas nagrań.
- Znieczulić mysz za pomocą mieszanki ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) wstrzykiwanej domięśniowo. Dawka ta głęboko znieczula zwierzę na około 1 godzinę. W razie potrzeby należy podać dodatkowe dawki w wysokości jednej trzeciej dawki początkowej.
- Umieść zwierzę na kocu grzewczym ustawionym tak, aby utrzymywał temperaturę 38 ± 1 ºC i ustabilizuj głowę zwierzęcia w stereotaktycznej ramie za pomocą dwóch nauszników i listwy do gryzienia. Uważaj, aby nie przebić błony bębenkowej za pomocą nauszników.
- Chroń oczy, nakładając kroplę żelu okulistycznego.
- Ogol skórę głowy nożyczkami i nałóż powidon-jod w celu dezynfekcji skóry.
- Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę i cofnąć okostną pokrywającą ciemieniową i bardziej rostralną część kości potylicznych.
- Przyklej lekki duraluminiowy sztyft (waga ~0,65 g, długość 30 mm, rysunek 1A) z okrągłą i płaską podstawą (średnica 5 mm) na czaszce. Przyklej srebrny drut do środka sztycy, pozostawiając jego końce wolne. Srebrny drut zostanie wykorzystany jako elektroda referencyjna do zapisu elektrofizjologicznego.
- Nałóż cienką warstwę światłoutwardzalnego kleju na czaszkę i podstawę słupka głównego. Odczekaj 10 sekund i umieść słupek nad obszarem rostralnym kości ciemieniowych, wzdłuż linii środkowej.
- Utwardź klej światłem za pomocą źródła niebieskiego światła przez 20 sekund, aby uzyskać skuteczną siłę wiązania.
- Wywierć trzy otwory wokół i za podstawą sztycy za pomocą wiertarki elektrycznej i małego wiertła.
- Umieść dwie zegarka (o długości ~2 mm) w wywierconych otworach, aby służyły jako dodatkowe punkty kontaktowe między czaszką a sceną główną. wymagają 11/2 obrotu, aby uzyskać dokładne dopasowanie. Przetestuj za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że nie są poluzowane.
- Włóż końcówkę srebrnego przewodu uziemiającego do trzeciego otworu, upewniając się, że styka się z oponą twardą. Nałóż niewielką kroplę wodoodpornego kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować drut do czaszki.
- Zastosuj kompozyt światłoutwardzalny, aby wzmocnić połączenie słupka głowy z czaszką. Zakryj podstawę sztycy, dolną część srebrnego drutu i, uważając, aby nie wystawać za lambda, aby umożliwić dostęp podczas nagrywania. Utwardzać za pomocą źródła światła niebieskiego.
- Cofnij mięsień z tyłu szyi w pobliżu jego przyczepu do czaszki. Używając małej trepanacji (o średnicy 2,35 mm), wywierć okrągłe okienko tuż pod szwem lambda i bocznie do linii środkowej, aby odsłonić dolny wzgórek (IC). Podciągnij kość pokrywającą delikatną pęsetą, gdy brzegi są luźne. Jeśli wystąpi krwawienie, spłucz je zimnym, sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby je zatrzymać.
- Za pomocą kompozytu wykonaj małą (~1 mm szerokości i ~1 mm wysokości) ściankę wokół okna i utwardź ją światłem.
- Przykryj odsłoniętą czaszkę i mięsień maścią z antybiotykiem. Następnie zwilż odsłoniętą powierzchnię układu scalonego sterylną solą fizjologiczną i przykryj ją wazeliną, wypełniając studzienkę powstałą po wykonaniu ściany wokół okna nagrywającego.
- Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie (0,03 mg/kg, rozcieńczony w stosunku 1:10 w jałowym roztworze soli fizjologicznej) jako środek przeciwbólowy.
- Trzymaj zwierzę na kocu grzewczym, aż się obudzi i wróć do klatki domowej, aby dojść do siebie po operacji przez trzy dni przed sesjami nagraniowymi. Zwierzęta trzymane w indywidualnych klatkach dla szczurów, aby zapobiec czyszczeniu galaretki przez kolegów z klatki i dotykaniu główki metalowej osłony siatki. Umieść trochę urozmaicenia w klatce, gdy zwierzę jest trzymane pojedynczo. Należy również codziennie zmieniać trociny, aby zapobiec infekcji i dokładnie sprawdzać, czy zwierzę prawidłowo wraca do zdrowia i nie wykazuje oznak dyskomfortu. Sprawdź również, czy wazelina znajduje się nad oknem nagrywania, chroniąc odsłonięty mózg.
3. Zapis elektrofizjologiczny i mikrojonoforeza
- Po powrocie do zdrowia należy dać zwierzęciu czas na zaaklimatyzowanie się w środowisku nagrywania i unieruchomić jego głowę. Przyzwyczaj zwierzę, mocując sztyft do uchwytu, podczas gdy mysz siedzi na specjalnie wykonanym amortyzowanym piankowym ograniczniku wyrzeźbionym zgodnie z rozmiarem jego ciała (Rysunek 1B). Ograniczy to ruchy myszy i przyczyni się do jej spokoju.
- Zacznij od 10-minutowych sesji i stopniowo zwiększaj czas trwania do 120 minut. Podczas sesji nagradzaj zwierzęta słodkimi płynami (mleko skondensowane, rozcieńczone w wodzie w proporcji 30:70) w określonych odstępach czasu. Później, podczas sesji nagraniowej, daj tę samą nagrodę na początku i na końcu sesji lub gdy żaden neuron nie jest izolowany.
- Jeśli zwierzę jest pobudzone przed nagraniem, należy wstrzyknąć łagodną uspokajający acepromazynę (2 mg/kg, dootrzewnowo). W zależności od interesującego układu nerwowego, środek uspokajający może wpływać na wyniki.
- Pozwól zwierzęciu swobodnie eksplorować komorę nagraniową przez 5 - 10 minut.
- Umieść ciało zwierzęcia w piankowym, specjalnie zaprojektowanym amortyzowanym ograniczniku (Rysunek 1B).
- Przymocuj sztyft do uchwytu przymocowanego do ramy stereotaktycznej (Rysunek 1C). To dobry moment, aby dać zwierzęciu płynną nagrodę.
- Przykryj ciało zwierzęcia bawełnianym kocem i luźno zapnij go za pomocą plastikowego półcylindra i taśmy klejącej.
- Wyjmij wazelinę z okienka nagrywania i spłucz ciepłą sterylną solą fizjologiczną.
- Rejestruj aktywność neuronalną i jonoforetyczne zastosowanie gabazyny.
- Umieść elektrodę wielolufową na uchwycie, sterowaną przez mikronapęd i podłączoną do mikromanipulatora.
- Podłącz przewody do nagrywania za pomocą małych zacisków krokodylkowych. Podłącz dodatni zacisk do końca elektrody wolframowej, a zacisk uziemiający do srebrnego drutu, który styka się z oponą twardą.
- Umieść niepowlekany srebrny drut wewnątrz każdej beczki tak, aby jeden koniec stykał się z roztworem, a drugi był dostępny. Podłącz te końce do urządzenia do mikrojonoforezy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
- Przesuń elektrodę wielolufową, aż końcówka zetknie się z powierzchnią mózgu. Zastosuj ciepłą sterylną sól fizjologiczną, aby zapobiec wysuszeniu tkanki mózgowej. W tym momencie należy zastosować prąd retencyjny (-10 nA dla gabazyny; sprawdź literaturę dla danego leku), aby uniknąć wycieku leku z końcówki lufy, szukając aktywności pojedynczej jednostki.
- Stosuj standardowe techniki izolowania aktywności zewnątrzkomórkowej pojedynczego neuronu. Uzyskaj obszar odpowiedzi częstotliwościowej (FRA) neuronu, tj. kombinację częstotliwości i intensywności zdolną do wywołania odpowiedzi, ponieważ neuron jest wrażliwy na te dźwięki.
- Wybierz dwie częstotliwości (f1 i f2), które wywołują podobną szybkość i wzór wypalania. Przedstaw każdą z tych częstotliwości jako rzadki i powtarzający się bodziec zgodnie z dziwacznym paradygmatem.
nuta: Krótko mówiąc, w paradygmacie dziwaków jedna częstotliwość (f1) jest przedstawiana jako bodziec powtarzalny o wysokim prawdopodobieństwie wystąpienia, podczas gdy druga (f2) to rzadko występujący bodziec dewiacyjny, losowo przeplatany między powtarzającymi się. W drugiej dziwacznej sekwencji względne prawdopodobieństwa dwóch bodźców są odwrócone.
- Uwolnij gabazynę, przesuwając prąd na wartości dodatnie (10 - 20 nA). Uzyskaj ponownie FRA i powtórz dziwaczny paradygmat pod aplikacją gabazyny. Utrzymać wyrzut do momentu zaobserwowania widocznego wpływu na szybkość wypalania; Zwykle trwa to 5 - 20 minut, w zależności od konkretnego leku, jego stężenia i wielkości prądu wyrzutowego. Powtórz protokół zapisu, aby uzyskać wartości pod wpływem leku.
- Zatrzymaj wstrzykiwanie, przywracając prąd do wartości przechowywania. Poczekaj, aż efekt leku zmyje się, monitorując, czy FRA lub odpowiedź na dziwaczny paradygmat powróci do wartości kontrolnych.
nuta: Sesje nagraniowe mogą trwać od 2 do 3 godzin dziennie i powinny zostać zakończone wcześniej, jeśli zwierzę wykazuje jakiekolwiek oznaki dyskomfortu lub zmagania się. Daj płynną nagrodę i przykryj komorę nagraniową wazeliną.
