Rejestrowanie aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnej w kokulturze neuron-astrocyt

Streszczenie

Źródło: Taga, A., et al. Ustanowienie Platformy Elektrofizjologicznej do Modelowania ALS z Regionalnie Specyficznymi Ludzkimi Pluripotencjalnymi Astrocytami i Neuronami. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje ustanowienie wspólnej kultury neuronów i astrocytów do rejestrowania aktywności sieci neuronalnej. Po ustaleniu wspólnej hodowli neuronów ruchowych i astrocytów na płytce z matrycą wieloelektrodową (MEA), synchroniczna rytmiczna aktywność elektryczna sieci neuronalnej została zarejestrowana zewnątrzkomórkowo za pomocą MEA.

Protokół

1. Współhodowla MN i astrocytów rdzenia kręgowego na płytkach z matrycą wieloelektrodową

1. Różnicuj i płytkuj neurony ruchowe i astrocyty, gdy są gotowe do użycia tego samego dnia i dojrzewają do dnia in vitro (DIV) 60 dla neuronów ruchowych i DIV 90 dla astrocytów.
2. Pokryj płytki MEA dzień przed lub w dniu posiewu w następujący sposób, jeśli pracujesz z 24-dołkowymi płytkami z tworzywa sztucznego (tabela materiałów).
3. Rozcieńczyć poliornitynę (PLO) w wodzie lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do 100 μg/ml.
   1. Dodać 15-20 μl do każdego dołka (w zależności od poziomu komfortu pipety), tworząc kroplę na środku studzienki pokrywającą obszar elektrod i otoczenia, ale nie całą studzienkę.
   2. Uważaj, aby nie uszkodzić elektrod z końcówką pipety. Bądź spójny z objętością od studzienki do studni, aby zapewnić pokrycie tej samej powierzchni w każdym dołku.
   3. Inkubować PLO w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę (najlepiej 2 godziny).
      nuta: Małe objętości wyschną, jeśli w płytkach nie będzie wystarczającej wilgotności. Dodaj wodę do komór otaczających studnie, aby zapewnić wystarczającą wilgotność przez cały czas powlekania i nagrywania.
4. Odessać jak najwięcej PLO za pomocą plastikowej końcówki do mikropipety. Uważaj, aby nie dotykać elektrod. Umyć trzykrotnie 250 μl wody. Jeśli używasz aspiratora próżniowego do mycia, nie pozwól, aby końcówka zbliżyła się do układu elektrod. Po trzecim praniu usuń jak najwięcej wody, w razie potrzeby używając końcówki pipety. Pozostaw powierzchnię do wyschnięcia pod kapturem do hodowli komórkowych ze zdjętą pokrywą.
5. Po wyschnięciu powierzchni płytki dodać lamininę rozcieńczoną do 10 μg/ml w PBS. Użyj 15-20 μl, aby pokryć każdy układ elektrod. Dodać wodę do komór wilgotnościowych, założyć pokrywę i przywrócić płytkę do inkubacji w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
6. W dniu posiewu przepłukać raz hodowle neuronów ruchowych (MN) i astrocytów PBS i dodać trypsynę 0,05% w temperaturze 37 °C w celu podniesienia komórek (5 min). Zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej inhibitor trypsyny i przemyć płytki pożywką lub zasadą, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić za pomocą pipety o pojemności 1000 μl, aby wytworzyć 1 ml zawiesiny pojedynczej komórki. Podczas ponownego zawieszania MN i astrocytów należy przejść na pożywkę do kohodowli (Tabela 1), z dodatkiem 20 μM związanego z Rho, inhibitora kinazy serynowo-treoninowej tworzącej białko serynowo-treoninowe (ROCK-I).
7. Policz MN i astrocyty równolegle za pomocą hemocytometru. Podczas liczenia i wykonywania obliczeń należy przykryć zawiesiny komórek i umieścić je w styropianowym stojaku o temperaturze 4 °C.
8. Obliczyć objętość wymaganą do ponownego zawieszenia kultur do stężenia 5 x 10⁴ komórek na 5 μl w przypadku neuronów ruchowych i 2,5 x 10⁴ komórek na 5 μl w przypadku astrocytów. Odwirować 1 ml zawiesiny komórek o stężeniu 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w obliczonej objętości.
9. Oblicz liczbę pożądanych studzienek do wysiania i pomnóż ją przez 5 μl każdej zawiesiny komórek. Połączyć wymaganą objętość zawiesin neuronów i astrocytów w stosunku 1:1 i mieszać pipetując, aż do całkowitego połączenia (zwykle dwukrotnie), ale unikając zbyt agresywnej gry.
10. Usunąć lamininę z każdej studzienki płytki MEA za pomocą końcówki pipety. Przenieś 10 μl końcowej połączonej zawiesiny komórek do każdej studzienki, tworząc małą kropelkę pokrywającą matrycę elektrod, aby zapewnić gęstość komórek 5 x 10⁴ MN i 2,5 x 10⁴ astrocytów na dołek.
    nuta: Wysoka gęstość komórek w połączonej zawiesinie wymaga częstego ponownego zawieszania między studzienkami na etapie wysiewu, aby zapewnić dokładne i spójne zliczanie komórek.
11. Włóż płytki do inkubatora na 20-30 minut. Należy uważać, aby nie naruszyć kropelki komórek i pozwolić komórkom na uformowanie początkowych przyczepów na płytkach.
12. Po 20-30 minutach dodaj ciepłą pożywkę do współhodowli + ROCK-I do każdej studzienki, pipetując 250 μl w dół na ściankę każdej studzienki, a następnie dodatkowe 250 μl w dół ścianki tego samego dołka po przeciwnej stronie. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
13. Zbadaj płytki dzień po wysiewie (dzień 1 kokultury). Jeśli występuje znaczna ilość szczątków komórkowych lub martwych komórek, należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę do kohodowli zawierającą ROCK-I. W przeciwnym razie należy zmienić pożywkę drugiego dnia po wysiewie (dzień 2 wspólnej hodowli) na pożywkę kokulturową bez ROCK-I. Wykonuj wymianę połowy pożywki (zasysanie 50% i dodawanie 60% końcowej objętości, aby uwzględnić parowanie) dwa razy w tygodniu.
14. W przypadku stosowania systemów MEA z jednostudzienkowymi płytkami szklanymi o średnicy 30 mm (tabela materiałów), przygotowanie płytki może zająć 2 lub więcej dni. Wykonaj poniższe czynności, aby to zrobić.
15. Podnieś komórki i resztki komórek z poprzednich kultur MEA za pomocą 0,05% trypsyny przez 5-15 minut.
16. Odessać trypsynę i spłukać trzykrotnie wodą.
17. Sterylizować, dodając 70% etanolu i inkubować w kapturze przez 10 minut. Odessać etanol, a następnie trzykrotnie spłukać wodą.
18. Nałóż 1% anionowy detergent z enzymem proteazy w wodzie. Przykryj talerze pokrywką i zawiń folią termoplastyczną i folią aluminiową, a następnie pozostaw na noc na bujaku w temperaturze pokojowej.
19. Zassać detergent, a następnie spłukać trzykrotnie wodą.
20. Jeśli planujesz przechowywać talerze, dodaj odpowiednią ilość wody. Przykryj talerze pokrywką i owiń je folią termoplastyczną oraz folią aluminiową i pozostaw w lodówce do następnego użycia.
21. Jeśli planujesz powlekanie, pozwól powierzchni wyschnąć pod kapturem hodowli komórkowej.
22. Jeśli potrzebna jest dodatkowa sterylizacja (np. wcześniejsza infekcja lub niedawne użycie), tylko w tym momencie należy wystawić płytki MEA na działanie światła ultrafioletowego (UV) pod maską przez 30-60 min.
    nuta: Unikanie częstego światła UV zapobiegnie uszkodzeniu elektrod. Stosowanie światła UV, gdy na płytkach znajduje się surowica, spowoduje niesprawne elektrody, dlatego należy je stosować tylko na czyszczonych płytkach.
23. Gdy płytki całkowicie wyschną, przystąp do czyszczenia plazmowego przez 1 minutę, aby naładować szklaną powierzchnię płytek MEA i zwiększyć skuteczność powlekania. Czyścić plazmowo co najmniej raz na 4-5 cykli czyszczenia płyt MEA.
    1. Alternatywnie, gdy czyszczenie plazmowe nie jest wykonalne lub nieuzasadnione, należy dodać wystarczającą ilość pożywki zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS), aby pokryć powierzchnię płytek MEA i umieścić je z powrotem w inkubatorze na noc.
24. Użyj powłoki PLO (poliornityny)/Lamininy. Dodać roztwór PLO (100 μg w PBS) natychmiast po oczyszczeniu plazmowym lub zasysaniu i wypłukaniu pożywki zawierającej FBS.
25. Płytki komórek jak powyżej w następujących gęstościach: 1 x 10⁵ astrocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-A) / płytka i 5 x 10⁵ ludzkich pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-MN) / płytka.

2. Zapis w matrycy wieloelektrodowej

1. Wyodrębnij surowe dane dotyczące napięcia przy częstotliwości próbkowania 12,5 kHz, używając filtra Butterwortha z filtrem górnoprzepustowym 200 Hz i filtrem dolnoprzepustowym 3 kHz. Ustaw rozpoznawanie skoków jako chwilowe punkty czasowe napięć ≥6 odchyleń standardowych od linii bazowej. Zidentyfikuj wybuchy jako aktywność z >5 skokami w ciągu 100 ms. Zdefiniuj aktywność sieci, gdy ponad 35% wszystkich aktywnych elektrod wystrzeliwuje w ciągu 100 ms z minimalnymi 50 impulsami na impuls sieci.
2. Rozpocznij nagrywanie tak szybko, jak to możliwe po Co-Culture (CC) Dzień 1.
   nuta: Aktywność elektryczna będzie rzadko odnotowywana przed CC Day 3.
3. Równoległe hodowle płytkowe o podobnej gęstości i repliki na odpowiednich płytkach hodowlanych lub szkiełkach nakrywkowych do testów biochemicznych, immunocytochemii (ICC) lub ilościowego PCR (qPCR).
4. Wykonuj nagrania z temperaturą ustawioną na 37 °C i CO₂ na poziomie 5%. Przenieść płytki do maszyny i pozostawić je do zrównoważenia przez co najmniej 5 minut przed zapisem.
5. Rejestruj podstawową aktywność co drugi dzień lub co tydzień, przez 1-15 minut, w zależności od projektu eksperymentalnego. Nie nagrywaj przez co najmniej 1 godzinę po wymianie nośnika, a najlepiej odczekaj 24 godziny po każdej wymianie nośnika.
6. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, należy zmienić pożywkę (tj. wymianę połowy pożywki, jak w kroku 1.14) po każdym nagraniu, w którym wieczko sterylnej płytki musi zostać otwarte na zewnątrz sterylnego kaptura (tj. po zastosowaniu związków leczniczych). Wykonaj pełną wymianę pożywki i płukanie w celu wypłukania leków, jeśli płytki mają być nadal używane po leczeniu farmakologicznym.
7. Do celów analizy należy użyć co najmniej trzech kontrprób technicznych i biologicznych dla każdego warunku. Wyrazić dane elektrofizjologiczne jako n ≥ 3 powtórzenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterylne płytki hodowlane 10 cm	sokół	353003
25 cm2 sterylne kolby hodowlane	sokół	353136
System filtrów CA 500 ml 0,2 μm	Corning	430769
Pipeta 5 ml	sokół	357543
6-dołkowe sterylne płytki hodowlane	sokół	Numer katalogowy: 3046
Płytki Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Platforma Axion Edge MEA	Axion	Ostrze Maestro
Matryca membranowa podstawna - Matrigel	Corning	354277	Szczegóły w protokole
Mikroskop laboratoryjny (sterylny pod kapturem do hodowli komórkowych)	Zeiss	Numer telefonu 415510-1100-000	Primo Vert
Rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF)	Peprotech	450-13	Rozpuść 100 μg w 1 ml sterylnego PBS, a następnie dodaj 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 μg/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Zbiorniki CO2 i reduktor do Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC (wersja angielska
DMEM/F12	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 113300	Koncentracja robocza 1x
Suplement Essential 8 Medium + Essential 8	Rybak termiczny	A1517001	Połącz 10 ml suplementu Essential 8 (10x) z 500 ml pożywki Essential 8 Growth Medium (1x)
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Rybak termiczny	16140071	Koncentracja robocza 1x
Hemocytometr	Nauki o mikroskopii wyborczej	Numer katalogowy: 63510-20
Kontrolowana wilgotność Inkubator do hodowli komórkowych	Rybak termiczny	Okręg wyborczy 370	ustawione na 37 ºC, 5 % CO2
Laminina	Rybak termiczny	23017-015	Roztwór podstawowy 1 mg/ml, stężenie robocze 10 μg/ml (powłoka), 1 μg/ml (pożywka komórkowa)
L-glutamina	Rybak termiczny	Numer katalogowy 25030	Rozpuść 2 mg LDN w 500 μl chloroformu, aby uzyskać 10 mM bulionu. Podzielić to na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C. Przed użyciem należy najpierw rozcieńczyć materiał od 1 do 10 w DMSO [do 1 mM], a następnie rozcieńczyć 1:5000 z 1 mM w żądanym podłożu, aby uzyskać roztwór roboczy 0,2 μM
Płyty szklane MEA	Systemy wielokanałowe	60MEA200/30iR-Ti-gr	Koncentracja robocza 100x
Piper wielokanałowy P200	Gilson	PJ22224
Neuropodstawowy	Rybak termiczny	21103049
Aminokwasy endogenne (NEAA)	Rybak termiczny	11140050	Koncentracja robocza 1x
Ołówek/Streptomycyna	Rybak termiczny	15140122	Koncentracja robocza 100x
Poliornityna (PLO)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3655	Koncentracja robocza 100x
Chlorek potasu (KCl)	nie	nie	Rozpuścić 100 mg w 1 ml ddW, aby otrzymać 100 mg/ml roztworu podstawowego. Porcjować zapas w probówkach o pojemności 100 μl. (stężenie robocze 100 μg/mL)
Purmorfamina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Stężenie robocze100 mM
Inhibitor ROCK	Peprotech	1293823	Odwirować na krótko przed rozpuszczeniem. Rozpuścić 100 μg w 1 ml PBS do 100 μg/ml, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 μg/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Sterylne kaptury do hodowli komórkowych	Firma piekarska	Zobacz materiał SG-600	Rozpuścić 5 mg w 1480 μl dH2O do uzyskania 10 mM zapasu, podwielokrotności i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:500 do użycia. (stężenie robocze 20 μM).
Suplement B - B27 Suplement	Rybak termiczny	21985023
Wirówka do hodowli komórkowych na stole	Rybak termiczny	75004261	Stężenie robocze 50x
Folia termoplastyczna - Parafilm	PARAFILM	Zobacz materiał P7793	Legenda Sorvalla X1R
Trypsyna-EDTA (0,05%)	Rybak termiczny	2530054	Koncentracja robocza 1x
Kąpiel wodna	Rybak termiczny	2332	Izotemp