Jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w śródbłonku mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Hakim, M. A. et al. Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Wideo pokazuje jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i zmian potencjału błonowego w komórkach śródbłonka mysich odcinków tętnic mózgowych. Izolowany śródbłonek jest ładowany fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia i traktowany lekiem, który indukuje wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia, powodując zmianę potencjału błony. Fluorescencja wskaźnika umożliwia pomiar poziomu wapnia, a elektroda rejestrująca jest wprowadzana do ogniwa w celu pomiaru zmian potencjału błony.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Rozwarstwienie i izolacja tętnicy mózgowej

UWAGA: Wszystkie procedury preparacji wymagają powiększenia próbki (do 50x) za pomocą mikroskopów stereoskopowych i oświetlenia dostarczanego przez światłowodowe źródła światła. Aby wykonać procedury preparacyjne w celu izolacji mózgu i tętnic, użyj zaostrzonych narzędzi preparacyjnych. Narzędzia do mikrodysekcji do izolowania i czyszczenia tętnic obejmują zaostrzone kleszcze z cienką końcówką i nożyczki do preparowania w stylu Vannas (ostrza od 3 do 9,5 mm).

1. Izolacja mózgu myszy
   1. Znieczulić mysz C57BL/6 (w wieku 3-30 miesięcy; samiec lub samica) poprzez inhalację izofluranu (3% przez 2-3 min), a następnie odciąć głowę zwierzęcia natychmiast po całkowitej indukcji znieczulenia. Umieścić głowę na szalce Petriego (średnica 10 cm, głębokość 1,5 cm) zawierającej zimny (4 °C) zero Ca²⁺ Fizjologiczny roztwór soli (PSS) pod mikroskopem stereoskopowym.
   2. Patrząc przez mikroskop, usuń skórę i włosy nad czaszką i usuń nadmiar krwi za pomocą zimnego zera Ca²⁺ PSS. Wykonaj nacięcie, używając tylko końcówek standardowych nożyczek preparacyjnych (np. ostrza 24 mm), zaczynając od kości potylicznej i rozciągając się w górę przez kość nosową czaszki.
   3. Ostrożnie otwórz czaszkę wzdłuż nacięcia za pomocą kleszczy z grubą końcówką i oddziel tkankę łączną, aby odizolować mózg za pomocą nienaruszonego Kręgu Willisa.
      UWAGA: Alternatywnie, kleszcze Littauera do cięcia kości mogą być użyte do otwarcia czaszki i odsłonięcia mózgu.
   4. Delikatnie umyj izolowany mózg zimnym zerowym Ca²⁺ PSS w zlewce, aby usunąć krew. Umieść brzuszną stronę mózgu skierowaną do góry w komorze zawierającej zimny roztwór preparacyjny w celu wyizolowania tętnic mózgowych (ryc. 1A).
2. Izolacja tętnic mózgowych
   UWAGA: Tylna tętnica mózgowa została wybrana jako reprezentatywny model badania śródbłonka naczyń mózgowych dla tego protokołu.
   1. Zabezpiecz wyizolowany mózg w zimnym roztworze preparacyjnym za pomocą kołków ze stali nierdzewnej (średnica 0,2 mm, długość ~11–12 mm), które zostaną włożone do polimeru krzemowego z dodatkiem węgla drzewnego, pokrywającego dno (głębokość ≥50 cm) szklanej szalki Petriego.
   2. Aby utrzymać schłodzoną temperaturę PSS podczas sekcji, należy użyć komory rozwarstwiania chłodzonej układem chłodniczym pracującym w sposób ciągły w mieszaninie wody i glikolu etylenowego w stosunku 1:1. Alternatywnie sekcję można przeprowadzić na świeżym lodzie.
   3. Chirurgicznie odizoluj tylne tętnice mózgowe (segmenty ~0,3 do 0,5 cm, brak napięcia osiowego) od tylnych tętnic komunikacyjnych i podstawnych za pomocą narzędzi do mikrodysekcji, nożyczek typu Vannas i zaostrzonych kleszczyków z cienką końcówką (ryc. 1B). Użyj kołków ze stali nierdzewnej (średnica 0,1 mm, długość ~13–14 mm), aby zabezpieczyć obie izolowane tylne tętnice mózgowe w roztworze preparacyjnym na szalce Petriego (ryc. 1C).
   4. Ostrożnie oczyść izolowane tylne tętnice mózgowe, usuwając tkankę łączną za pomocą zaostrzonych kleszczyków z cienką końcówką (ryc. 1D). Pokrój nienaruszone tętnice na segmenty (długość 1–2 mm) w celu trawienia enzymatycznego (ryc. 1D; wstawka).

2. Przygotowanie rurki śródbłonkowej i superfuzja

1. Przygotuj aparat do rozcierania za pomocą mikroskopu wyposażonego w obiektywy (10x, 20x i 40x), kamerę oraz aluminiowy stolik z komorą i mikromanipulatorami. Zabezpieczyć mikrostrzykawkę ze sterownikiem pompy przylegającym do stolika i próbki (Rysunek 2A).
2. Całkowicie napełnić pipetę trójfazową olejem mineralnym i zabezpieczyć ją nad tłokiem mikrostrzykawki. Następnie, za pomocą mikrostrzykawki ze sterownikiem pompy, pobrać roztwór dysocjacyjny do pipety (~130 nl) na wierzch oleju mineralnego, upewniając się, że w pipecie nie ma pęcherzyków powietrza.
3. Umieść nienaruszone odcinki tętnic w 1 ml roztworu dysocjacyjnego w szklanej probówce o pojemności 10 ml (ryc. 2B), zawierającej 0,31 mg / ml papainy, 0,5 mg / ml ditioerytrytolu, 0,75 mg / ml kolagenazy i 0,13 mg / ml elastazy. Inkubować w temperaturze 34 °C przez 10–12 minut w celu częściowego roztrawienia.
4. Po roztrawieniu zastąp roztwór enzymu ~ 5 ml świeżego roztworu dysocjacyjnego. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś jeden segment do komory zawierającej roztwór dysocjacyjny w temperaturze pokojowej (RT).
5. Umieścić pipetę w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieścić ją blisko jednego końca strawionego naczynia. Ustaw szybkość w zakresie od 2 do 5 nL/s na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie (Rysunek 2C; wstawka).
6. Patrząc w powiększeniu od 100x do 200x, wycofaj i wysuń segment tętniczy, aby zdysocjować komórki mięśni gładkich, jednocześnie wytwarzając rurkę śródbłonka. W razie potrzeby ostrożnie użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby oddzielić zdysocjowaną przydankę i wewnętrzną elastyczną blaszkę od rurki śródbłonka. Upewnij się, że wszystkie komórki mięśni gładkich są zdysocjowane i że tylko komórki śródbłonka pozostają jako nienaruszona "rurka" (ryc. 2C).
7. Za pomocą mikromanipulatorów przymocuj każdy koniec rurki śródbłonka do szkiełka pokrywy komory superfuzyjnej za pomocą pipet przypinających ze szkła borokrzemianowego (rysunek 2D).
8. Wypłukać zdysocjowane komórki przydanki i mięśni gładkich z komory i zastąpić roztwór dysocjacyjny roztworem 2 mM CaCl₂ PSS. Przenieś mobilną platformę z zabezpieczoną rurką śródbłonka na mikroskop superfuzji i stanowisko eksperymentalne.
9. Użyj 6 czystych zbiorników o pojemności 50 ml (rysunek 3A) do ciągłego dostarczania PSS i odpowiednich roztworów leków podczas eksperymentu, w zależności od potrzeb. Użyj wbudowanego zaworu sterującego przepływem, aby ręcznie ustawić natężenie przepływu zgodnie z przepływem laminarnym, jednocześnie dopasowując przepływ zasilania do ssania próżniowego. Dostarczyć PSS do komory (ryc. 3B) w celu przełączenia rurki śródbłonka przez ≥ 5 minut przed zapisaniem danych tła i załadowaniem barwnika.

3. Ustawienia obciążenia barwnika, wypłukiwania i temperatury

1. Włączyć wszystkie elementy systemu fotometrycznego do pomiaru [Ca²⁺]_i. Użyj mikroskopu na stanowisku eksperymentalnym (rysunek 3C), aby wyświetlić rurkę śródbłonka w powiększeniu 400x i skupić się na komórkach w oknie fotometrycznym za pomocą pakietu oprogramowania systemu fotometrycznego.
2. Zmierzyć średnicę rurki śródbłonka i zapisać wartości autofluorescencji tła zgodnie z emisją 510 nm podczas wzbudzenia naprzemiennego przy 340 i 380 nm (≥10 Hz).
3. Aby zmierzyć wewnątrzkomórkowe odpowiedzi Ca²⁺ ([Ca^{2 +}] _i), należy obciążyć rurkę śródbłonkową barwnikiem Fura-2 AM (ester fura-2-acetoksymetylowy, stężenie końcowe 10 μM) w temperaturze pokojowej i pozostawić ~30–40 minut przy braku światła.
4. Wznowić superfuzję śródbłonka ze świeżym PSS przez ~ 30–40 minut, aby wypłukać nadmiar barwnika i umożliwić wewnątrzkomórkową Fura-2 AM deestryfikację. W okresie wymywania stopniowo zwiększaj temperaturę od RT do 37 °C za pomocą regulatora temperatury (Rysunek 3A) z wbudowaną grzałką, a następnie utrzymuj ją na poziomie 37 °C przez cały czas trwania eksperymentu.
   nuta: Zalecane stopniowe przejście między temperaturą względną a temperaturą 37 °C obejmuje trzy etapy (np. 5 °C) z czasem równoważenia ≥5 min na każdym kroku.

4. Jednoczesny pomiar [Ca²⁺]_i i V_m

1. Włącz wszystkie inne urządzenia i pakiet oprogramowania elektrometru do pomiaru potencjału błony (V_m, patrz Rysunek 3, Rysunek 4). Dostosuj odpowiednio szybkość akwizycji danych (≥10 Hz).
2. Pociągnij ostrą elektrodę i zasyp 2 M KCl. W przypadku badań sprzężenia międzykomórkowego poprzez transfer barwnika należy wypełnić mikroelektrody 0,1% jodkiem propidyny rozpuszczonym w 2 M KCl.
3. Zamocuj elektrodę na srebrnym drucie pokrytym chlorkiem w uchwycie na pipetę przymocowanym do głowicy elektrometru, stage zabezpieczonym mikromanipulatorem. Użyj mikromanipulatora, aby na krótko umieścić końcówkę elektrody w przepływającym PSS w komorze, patrząc przez obiektyw 4x.
4. Ustaw spoczynkową V_m na 0 zgodnie z uziemionym potencjałem kąpieli. Umieść końcówkę elektrody tuż nad komórką rurki śródbłonka. W razie potrzeby użyj dźwiękowych monitorów linii bazowej połączonych z elektrometrami, aby skojarzyć wysokość dźwięku z potencjalnymi nagraniami.
5. Zwiększ powiększenie do 400x za pomocą obiektywu 40x i w razie potrzeby zmień położenie końcówki elektrody. Dostosuj okno fotometryczne za pomocą oprogramowania fotometrycznego, aby skupić się na ~ 50 do 80 komórkach śródbłonka.
6. Delikatnie umieść elektrodę w jednej z komórek rurki śródbłonka za pomocą mikromanipulatora i odczekaj ≥2 minuty, aż spoczynkowy_{V m} się ustabilizuje. Podobnie włóż drugą elektrodę do innego ogniwa (odległość ≥100 μm) od pierwszego ogniwa nabitego pierwszą elektrodą.
7. Gdy spoczynkowe V_m ustabilizuje się na oczekiwanych wartościach (-30 do -40 mV), włącz PMT na granicy fluorescencji przy braku światła i rozpocznij akwizycję wewnątrzkomórkowego [Ca^{2 +} ]_i poprzez wzbudzanie Fura-2 naprzemiennie (10 Hz) przy 340 i 380 nm, zbierając emisję fluorescencji przy 510 nm.
   UWAGA: Aby przetestować międzykomórkowe sprzężenie elektryczne, prąd (± 0,5-3 nA, czas trwania impulsu ~20 s) może być dostarczony przez jeden elektrometr jako "Miejsce 1", a zmiany V_m mogą być rejestrowane za pomocą innego elektrometru jako "Miejsce 2" (odległość ≥100 μm).
8. Po ustaleniu jednoczesnych pomiarów V_m i [Ca^{2 +} ]_i, przed zastosowaniem leków należy odczekać ~5 minut na superfuzję rurki śródbłonka z PSS przy stałym natężeniu przepływu laminarnego.
9. Nanieść lek (np. trifosforan adenozyny [ATP]) przygotowany w PSS do komory superfuzyjnej o stałym natężeniu przepływu. Po ~3 minutach (lub okresie czasu odpowiednim dla kinetyki leku) przemyć PSS do momentu, gdy V_m i stosunek F₃₄₀/F₃₈₀ powrócą do warunków wyjściowych. Oznacz odpowiednie nagrania jako czasowo zsynchronizowane w pakietach oprogramowania fotometru i elektrometru podczas każdego przejścia rozwiązań.
10. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij elektrodę z ogniwa za pomocą mikromanipulatora i zwróć uwagę na V_m ~ 0 mV, zgodnie z odniesieniem elektrody do kąpieli. Zatrzymaj odpowiednie nagrania V_{, m} i [Ca²⁺]_i i zapisz je w pliku w celu analizy danych.

Wyniki

Rycina 1: Izolacja tętnicy mózgowej od mózgu. (A) Mózg wyizolowany z nienaruszonymi tętnicami (biała strzałka wskazuje tylną tętnicę mózgową) w roztworze do desekcji. (B) Powiększony widok tylnej tętnicy mózgowej (biała strzałka; ~3x vs. Panel A). (C) Izolowane tylne tętnice mózgowe zabezpieczone szpilkami ze stali nierdzewnej w naczyniu na...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
glukoza	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Stany Zjednoczone)	Kontroler G7021
Zawartość NaCl	Sigma	Zobacz materiał S7653
MgCl2	Sigma	Zobacz materiał M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPESY	Sigma	Zobacz materiał H4034
Kcl	Sigma	Zobacz materiał P9541
NaOH	Sigma	Zobacz materiał S8045
Atp	Sigma	A2383
Hcl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, Pensylwania, Stany Zjednoczone)	A466250
Kolagenaza (mieszanka typu H)	Sigma	Zobacz materiał C8051
Ditioerytrytol	Sigma	Zobacz materiał D8255
papaina	Sigma	Zobacz materiał P4762
Elastaza	Sigma	E7885
Bsa	Sigma	A7906
Jodek propidyny	Sigma	Zobacz materiał P4170
Dmso	Sigma	Zobacz materiał D8418
Barwnik Fura-2 AM	Invitrogen, Karlowe Wary, CA, Stany Zjednoczone	F14185
Agregat chłodniczy z recyrkulacją (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Naukowy	13874647
Komora do superfuzji z pleksiglasu	Warner Instruments, Camden, CT, Stany Zjednoczone	Samolot RC-27
Szklane szkiełko nakrywkowe (2,4 × 5,0 cm)	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-548-5 mln
Platforma z anodyzowanego aluminium (średnica: 7,8 cm)	Instrumenty Warnera	PM6 lub PH6
Kompaktowy stolik aluminiowy	Siskiyou, Grants Pass, Oregon, Stany Zjednoczone	Rozdzielczość 8090P
Mikromanipulator	Siskiyou powiedział:	MX10
Mikroskopy stereoskopowe	Zeiss, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	Stemi 2000 i 2000-C
Światłowodowe źródła światła	Schott, Moguncja, Niemcy & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Mikroskop odwrócony firmy Nikon	Nikon Instruments Inc., Melville, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał TS2
Obiektywy z kontrastem fazowym	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X i 20X)
Obiektywy fluorescencyjne	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) i 40X (Plan Fluor)
Mikroskop odwrócony firmy Nikon	Nikon Instruments Inc	Zaćmienie TS100
Sterownik pompy mikrostrzykawkowej (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone	SYS-MICRO4
Stół wibroizolacyjny	Produkcja techniczna, Peabody, MA, USA	Mikro-g
Wzmacniacze	Urządzenia molekularne, Sunnyvale, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Axoclamp 2B i Axoclamp 900A
Sceny czołowe	Urządzenia molekularne	HS-2A i HS-9A
Generator funkcyjny	EZ Digital, Seul, Korea Południowa	FG-8002
System pozyskiwania danych	Urządzenia molekularne, Sunnyvale, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Digidata 1550A
Dźwiękowe monitory bazowe	Ampol US LLC, Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone	BM-A-TM
Cyfrowy oscyloskop z pamięcią	Tektronix, Beaverton, Oregon, Stany Zjednoczone	TDS 2024B
Interfejs systemu fluorescencji, lampa ARC + zasilacz, Hyperswitch, PMT	Urządzenia molekularne, Sunnyvale, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Systemy IonOptix
Regulator temperatury	Instrumenty Warnera	TC-344B lub C
Grzałka liniowa	Instrumenty Warnera	SH- 27B
Sterownik zaworu	Instrumenty Warnera	Zobacz materiał VC-6
Zawór sterujący przepływem w linii	Instrumenty Warnera	FR-50
Ściągacz elektroniczny	Sutter Instruments, Novato, Kalifornia, Stany Zjednoczone	P-97 lub P-1000
Mikrokuźnia	Narishige, East Meadow, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	Drukarka MF-900
Rurki ze szkła borokrzemianowego (rozcieranie)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone	pozycji 1B100-4
Rurki ze szkła borokrzemianowego (przypinanie)	Instrumenty Warnera	G150T-6
Rurki ze szkła borokrzemianowego (ostre elektrody)	Instrumenty Warnera	GC100F-10
Filtr strzykawkowy (0,22 μm)	ThermoFisher Naukowy	Nr kat. 722-2520
Szklana szalka Petriego + węgiel drzewny Sylgard	Oprzyrządowanie Żywych Systemów, St. Albans City, VT, Stany Zjednoczone	DD-90-S-BLK
Nożyczki Vannas Style (3 mm i 9.5 mm)	Światowe instrumenty precyzyjne	555640S, 14364
Nożyczki z ostrzami 3 i 7 mm	Fine Science Tools (lub FST), Foster City, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Moria MC52 i 15000-00
Zaostrzone kleszcze z cienką końcówką	Certyfikat FST	Dumont #5 i Dumont #55