Artykuł metodologiczny

Ocena tworzenia połączeń nerwowych w kokulturze za pomocą zapisów elektrofizjologicznych

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Su, C. T. E., et al. Optogenetyczne podejście do oceny powstawania połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym. J. Vis. Exp. (2015)

Film demonstruje zapis elektrofizjologiczny w celu oceny połączeń neuronalnych między neuronami pochodzącymi z iPSC a neuronami korowymi szczura, potwierdzając kontakty synaptyczne w kokulturze poprzez aktywację światłoczułych kanałów jonowych i wykrywanie prądów postsynaptycznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zapisy elektrofizjologiczne neuronów pochodzących z iPSC

  1. Sprawdź, czy ludzkie iPSC zachowują się jak dojrzałe neurony.
    1. Znajdź komórki różniące się od ludzkich iPSC poprzez wizualizację tdTomato za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę zanurzeniową 60X (0,9 NA).
    2. Pociągnąć pipetę rejestrującą do oporu od 4 do 6 M. Ukrwić komórki w temperaturze pokojowej w roztworze zewnętrznym stale bąbelkującym 95%O2/5%CO2. Napełnij mikropipetę rejestrującą roztworem wewnętrznym.
    3. Łat tdTomato+ ogniwo w trybie całego ogniwa i rejestruj wyzwolenie potencjału czynnościowego w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu (czas trwania 1 s, przyrosty 10 pA) w cęgach prądowych.
  2. Sprawdź, czy potencjał czynnościowy komórek korowych eksprymujących ChR2 jest niezawodnie wywoływany przez stymulację światłem.
    1. Znajdź komórki korowe wyrażające ChR2 poprzez wizualizację GFP pod mikroskopem konfokalnym. Wykonaj zapis klamry krosowej całej komórki na komórkach korowych, wykonując kroki od 1.1.2 do 1.1.3.
    2. Sprawdzić, czy potencjał czynnościowy jest niezawodnie wywoływany przez oświetlenie świetlne lampą rtęciową (100 W). Długość fali filtra wzbudzenia wynosi 480/40 nm.
  3. Wykonaj stymulację optogenetyczną.
    1. Łat ogniwo tdTomato+ w trybie całego ogniwa i ustaw cęgi napięciowe na -70mV. Filtruj sygnały prądowe przy 2 kHz i digitalizuj przy 10 kHz. Rezystancja serii monitorów w zakresie od 10 do 20 M zapewnia spójność podczas nagrań.
    2. Stymuluj całe pole lampą rtęciową o mocy 100 W z filtrem wzbudzenia 480/40 nm przez 30 sekund.
    3. Rejestruj prądy postsynaptyczne (PSC) połatanych komórek indukowanych przez fotostymulację presynaptycznych neuronów korowych eksprymujących ChR2. Wykrywanie i pomiar PSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zawartość NaClSigmaZobacz materiał S7653
KclSigmaZobacz materiał P5405
NaHCO3SigmaZobacz materiał S5761
NaH2PO4Przywra71505
MgCl2SigmaZobacz materiał M8266
CaCl2SigmaZobacz materiał C1016
D(+)-GlukozaSigmaTelefon G7520Do badań elektrofizjologicznych
K-glukonianSigmaZobacz materiał P1847
KohKANTO ChemicznyNumer telefonu 3234400
HEPESYSigmaH3375Do badań elektrofizjologicznych
EGTA (EGTA)SigmaE3889
Na2ATPSigmaA7699
Na3GTPSigmaTelefon komórkowy G8877
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoŚwiatowe instrumenty precyzyjne, Inc1604323
Lampa rtęciowa o krótkim łukuFirma OSRAMHBO 103 W/2
TGL powiedział: powiedział: (wersja angielska)

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja elektrofizjologicznastymulacja optogenetycznametoda patch clamp w konfiguracji whole cellmikroskopia konfokalnapr dy postsynaptycznewiat oczu e kana y jonoweneurony pochodz ce z iPSCneurony korowe szczurasystem kokulturyocena po cze synaptycznych

Powiązane artykuły