Ocena tworzenia połączeń nerwowych w kokulturze za pomocą zapisów elektrofizjologicznych

Streszczenie

Źródło: Su, C. T. E., et al. Optogenetyczne podejście do oceny powstawania połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym. J. Vis. Exp. (2015)

Film demonstruje zapis elektrofizjologiczny w celu oceny połączeń neuronalnych między neuronami pochodzącymi z iPSC a neuronami korowymi szczura, potwierdzając kontakty synaptyczne w kokulturze poprzez aktywację światłoczułych kanałów jonowych i wykrywanie prądów postsynaptycznych.

Protokół

1. Zapisy elektrofizjologiczne neuronów pochodzących z iPSC

1. Sprawdź, czy ludzkie iPSC zachowują się jak dojrzałe neurony.
   1. Znajdź komórki różniące się od ludzkich iPSC poprzez wizualizację tdTomato za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę zanurzeniową 60X (0,9 NA).
   2. Pociągnąć pipetę rejestrującą do oporu od 4 do 6 M. Ukrwić komórki w temperaturze pokojowej w roztworze zewnętrznym stale bąbelkującym 95%_O2/5%_CO2. Napełnij mikropipetę rejestrującą roztworem wewnętrznym.
   3. Łat tdTomato+ ogniwo w trybie całego ogniwa i rejestruj wyzwolenie potencjału czynnościowego w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu (czas trwania 1 s, przyrosty 10 pA) w cęgach prądowych.
2. Sprawdź, czy potencjał czynnościowy komórek korowych eksprymujących ChR2 jest niezawodnie wywoływany przez stymulację światłem.
   1. Znajdź komórki korowe wyrażające ChR2 poprzez wizualizację GFP pod mikroskopem konfokalnym. Wykonaj zapis klamry krosowej całej komórki na komórkach korowych, wykonując kroki od 1.1.2 do 1.1.3.
   2. Sprawdzić, czy potencjał czynnościowy jest niezawodnie wywoływany przez oświetlenie świetlne lampą rtęciową (100 W). Długość fali filtra wzbudzenia wynosi 480/40 nm.
3. Wykonaj stymulację optogenetyczną.
   1. Łat ogniwo tdTomato+ w trybie całego ogniwa i ustaw cęgi napięciowe na -70mV. Filtruj sygnały prądowe przy 2 kHz i digitalizuj przy 10 kHz. Rezystancja serii monitorów w zakresie od 10 do 20 M zapewnia spójność podczas nagrań.
   2. Stymuluj całe pole lampą rtęciową o mocy 100 W z filtrem wzbudzenia 480/40 nm przez 30 sekund.
   3. Rejestruj prądy postsynaptyczne (PSC) połatanych komórek indukowanych przez fotostymulację presynaptycznych neuronów korowych eksprymujących ChR2. Wykrywanie i pomiar PSC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zawartość NaCl	Sigma	Zobacz materiał S7653
Kcl	Sigma	Zobacz materiał P5405
NaHCO3	Sigma	Zobacz materiał S5761
NaH2PO4	Przywra	71505
MgCl2	Sigma	Zobacz materiał M8266
CaCl2	Sigma	Zobacz materiał C1016
D(+)-Glukoza	Sigma	Telefon G7520	Do badań elektrofizjologicznych
K-glukonian	Sigma	Zobacz materiał P1847
Koh	KANTO Chemiczny	Numer telefonu 3234400
HEPESY	Sigma	H3375	Do badań elektrofizjologicznych
EGTA (EGTA)	Sigma	E3889
Na2ATP	Sigma	A7699
Na3GTP	Sigma	Telefon komórkowy G8877
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Światowe instrumenty precyzyjne, Inc	1604323
Lampa rtęciowa o krótkim łuku	Firma OSRAM	HBO 103 W/2

TGL powiedział: powiedział: (wersja angielska)