Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jako platformy technologiczne, podejścia takie jak sekwencjonowanie następnej generacji, mikromacierze oraz qRT-PCR dają duże nadzieje na poszerzenie naszej wiedzy na temat zakresu regulacji molekularnej. Nowsze metody, takie jak wysokorozdzielcze sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq)1, dostarczają nowych i obszernych informacji o ekspresji specyficznej dla tkanek lub stanów, takich jak względne poziomy transkryptów, alternatywny splicing oraz mikroRNA2-4. Perspektywy zastosowania metody RNA-Seq w porównawczym profilowaniu całego transkryptomu5 w obrębie poszczególnych tkanek lub pomiędzy osobnikami o odmiennych fenotypach otwierają nowe możliwości wyjaśnienia mechanizmów molekularnych uczestniczących zarówno w prawidłowych, jak i patologicznych stanach fizjologicznych. Niedawno przeprowadzono profilowanie całego transkryptomu w tkance mózgu człowieka, identyfikując różnice w ekspresji genów powiązane z progresją choroby6. Jednak zastosowanie sekwencjonowania następnej generacji nie zostało jeszcze w pełni zintegrowane z badaniami nad ssakami.
Badania ekspresji genów w modelach mysich wykazały odmienne profile w różnych jądrach mózgu przy zastosowaniu mikroskopii z przechwytywaniem laserowym (LCM) do wycinania próbek7,8. Chociaż LCM umożliwia pobieranie próbek z precyzją na poziomie pojedynczych komórek i dyskretnych obszarów mózgu, stosunkowo niska całkowita wydajność RNA uzyskiwana tą metodą może być ograniczająca dla RNA-Seq i innych metod profilowania w tkankach mózgu myszy, co może wymagać zastosowania suboptymalnych etapów amplifikacji próbek. W niniejszym protokole przedstawiono metodę mikrodyssekcji i ekstrakcji całkowitego RNA z dyskretnych obszarów mózgu myszy. Do wyizolowania 13 tkanek z seryjnych przekrojów coronalnych o grubości 750-μm z pojedynczego mózgu myszy zastosowano wycinaki tkankowe o określonej średnicy. Próbki pobrane metodą mikropunching zostają natychmiast zamrożone i zarchiwizowane. Całkowite RNA otrzymuje się z próbek przy użyciu technologii izolacji całkowitego RNA opartej na kuleczkach magnetycznych. Uzyskane próbki RNA charakteryzują się wydajnością i jakością odpowiednią do dalszego profilowania ekspresji. Ta strategia mikrodyssekcji stanowi realną alternatywę dla istniejących strategii pobierania próbek w celu uzyskania całkowitego RNA z dyskretnych obszarów mózgu, otwierając możliwości dla nowych odkryć w zakresie ekspresji genów.
Protokół
1. Konfiguracja i przygotowanie do pobierania próbek
- Uzupełnić zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS) wodorowęglanem sodu (0,44 g na 100 mL EBSS) i glukozą (0,884 g na 100 mL EBSS)9. Potraktować EBSS odczynnikiem DEPC (0,1 mL na 100 mL EBSS) przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C w butelce lub kolbie autoklawowalnej z nakrętką.
- Umieścić szklane pipety Pasteura o długości 5 ¾" w zlewce szklanej o pojemności 1000 mL, a pędzle artystyczne, włosiem skierowanym do góry, w szklanym cylindrze miernym o pojemności 100 mL. Dodać odpowiednią ilość roztworu DEPC (0,1 mL na 100 mL ddH2O), aby przykryć odpowiednio pipety i pędzle. Przykryć zlewkę i cylinder mierny folią aluminiową i inkubować przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C.
- Po 12-godzinnej inkubacji z DEPC podgrzać wszystkie materiały traktowane DEPC do temperatury >100 °C przez co najmniej 15 minut. Odstawić EBSS i schłodzić do temperatury pokojowej przed przechowywaniem w 4 °C. Odlać ddH2O ze zlewki i cylindra miernego; kontynuować inkubację w temperaturze >100 °C aż do wyschnięcia materiałów. Wyjąć, schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać do późniejszego użycia.
- W dniu eksperymentu potraktować wszystkie powierzchnie robocze preparatem RNaseZap.
- Umieścić i utrzymywać EBSS w kąpieli wodnej ustawionej na 40 °C. Aby zbuforować i natlenić EBSS, przesycić go mieszanką 95%/5% O2/CO2, umieszczając rurkę doprowadzającą gaz w wolnej od RNaz pipecie Pasteura, a następnie wkładając pipetę do EBSS. Przykryć otwór pojemnika z EBSS.
- Przygotować mikrotom do tkanek Stoelting do sekwencyjnego krojenia tkanki mózgowej. Potraktować górną i dolną powierzchnię mikrotomu preparatem RNaseZap. Przymocować prostokątny kawałek papieru filtracyjnego Whatman #4 do pleksiglasowej powierzchni urządzenia. Przymocować dwustronne ostrze brzytwy do ramienia urządzenia. Ustawić mikrometr na zero i dostosować minimalną wysokość ramienia tak, aby ostrze brzytwy przecięło papier filtracyjny, ale nie płytkę pleksiglasową.
- Przygotować wszystkie dodatkowe materiały potrzebne do mikrodysekcji, w tym wolne od RNaz szalki do hodowli komórkowej 60x15 mm, wycinaki do tkanek Harris Uni-Core, wolne od RNaz końcówki do mikropipet 200 μL do przymocowania do rurek gazowych w celu natleniania koronalnych przekrojów mózgu podczas wycinania mikropróbek, zakrzywione nożyczki, suchy lód oraz probówki do zbierania tkanek. Umieścić probówki na suchym lodzie.
2. Usunięcie mózgu i przekroje wieńcowe
- Umieść mysz w DecapiCone i dokonaj dekapitacji za pomocą gilotyny dla gryzoni. Wyjmij głowę z DecapiCone i połóż ją na płaskiej powierzchni. Za pomocą skalpela roztnij skórę wzdłuż linii środkowej czaszki, zaczynając około 3 mm za nozdrzami w kierunku ogona. Odchyl płaty skóry na boki, aby odsłonić czaszkę i oczodoły.
- Za pomocą zakrzywionych nożyczek przetnij oba nerwy wzrokowe, odcinając je od oka. Otwórz jamę czaszki, ostrożnie łamiąc kości potyliczne i międzyparietalne oraz usuwając grzbietowe kości ciemieniowe i czołowe. Używając kleszczy do kości (rongeura), rozbij kości nosowe i łzowe, aby odsłonić opłaty węchowe. Użyj zakrzywionych nożyczek, aby odciąć opłaty węchowe od przedniej części mózgu. Usuń cały mózg z nienaruszoną częścią tylną. Umieść mózg w górnej części wolnego od RNazy naczynia do hodowli komórkowej Cellstar o rozmiarze 60 x 15 mm. Przenieś naczynie na powierzchnię roboczą do pobierania próbek tkanki.
- Używając pipety wolnej od RNaz, ostrożnie zwilż papier filtracyjny przymocowany do przecinarki do tkanek za pomocą EBSS. Zwilż tkankę mózgu roztworem EBSS.
- Przenieś mózg na przecinarkę do tkanek i ustaw go w odpowiedniej orientacji. Uwaga: Mózg powinien być ułożony powierzchnią brzuszną na papierze filtracyjnym. Linia środkowa (szczelina międzyhemisferyczna) powinna być prostopadła do ostrza przecinarki, a przednia krawędź mózgu powinna przylegać do ostrza.
- Użyj pędzla artystycznego potraktowanego DEPC, aby unieruchomić mózg, wywierając lekki nacisk na jego powierzchnię grzbietową. Trzymając mózg nieruchomo, podnieś dźwignię uchwytu ostrza na wysokość około 4-5 cm nad powierzchnią tkanki i utrzymuj ją w tej pozycji. Usuń pędzel z powierzchni mózgu i ustaw wartość 750 μm za pomocą mikrometru. Puść dźwignię, aby przeciąć tkankę i utworzyć koronalny przekrój o grubości 750 μm.
- Podczas gdy ostrze przecinarki pozostaje w miejscu, użyj pędzla artystycznego w ruchu obrotowym, aby delikatnie odsunąć przekrój tkanki od powierzchni ostrza. Natychmiast umieść przekrój tkanki w natlenionym EBSS w szalce Petriego. Drugi badacz może rozpocząć od kroku 3.1.
- Powtarzaj kroki 2.5 i 2.6, aż do uzyskania seryjnych przekrojów mózgu w całej płaszczyźnie przednio-tylnej.
3. Mikrodyssekcja obszarów mózgu
- Dostosuj oświetlenie, aby zapewnić, że iluminacja próbki nie zostanie zakłócona podczas mikrosekcji tkanki. Dostosuj położenie i przepływ mieszaniny 95%/5% O2/CO2, aby utrzymać buforowane i natlenione środowisko dla tkanki podczas mikrosekcji.
- Zidentyfikuj koronalny przekrój mózgu zawierający obszar zainteresowania. Używając pędzla artystycznego, ułóż przekrój mózgu płasko na dnie szalki Petriego. Wybierz wycinak do tkanek o odpowiedniej średnicy na podstawie Tabeli 1 lub innych źródeł. Przytrzymując koronalny przekrój tkanki pędzlem, opuść ostrze wycinaka nad powierzchnię przekroju tkanki.
- Wywierając nacisk, przebij końcówką wycinaka przekrój tkanki, dociskając go mocno do dna szalki Petriego. Wykonaj kolisty ruch obrotowy, aby upewnić się, że obszar zainteresowania został oddzielony od otaczającej go tkanki. Ostrożnie unieś wycinak z przekroju tkanki i uwolnij mikrowycinek, pozwalając mu unosić się w EBSS.
- Używając pędzla artystycznego, niezwłocznie przenieś mikrowycinek tkanki do probówki do przechowywania w temperaturze -80 °C, umieszczonej na suchym lodzie. Tkanka powinna łatwo przywrzeć do ścianki probówki. Włóż probówkę z mikropróbką z powrotem na suchy lód.
- Powtórz kroki 3.2 – 3.4 dla każdego obszaru mózgu zainteresowania.
4. Archiwizacja tkanek
- Po zakończeniu mikrodysekcji należy użyć systemu skanującego VisionMate do zarejestrowania odpowiednich kodów kreskowych dla każdej probówki TrakMates zawierającej próbkę. Po zapełnieniu 96-miejscowego statywu na probówki TrakMates należy szybko zeskanować statyw i niezwłocznie umieścić próbki tkanek w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
5. Ekstrakcja całkowitego RNA
- Przygotować wolną od RNaz przestrzeń roboczą przy użyciu RNaseZap. Przygotować odpowiednią ilość mieszaniny kulek magnetycznych (Bead Mix) oraz roztworu do lizy i wiązania (Lysis/Binding Solution) zgodnie z opisem w protokole izolacji całkowitego RNA MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol10.
- Wyjąć próbki tkanek z zamrażarki -80 °C i umieścić probówki bezpośrednio na suchym lodzie.
- Do probówki TrakMates zawierającej próbkę dodać 100 μL roztworu Lysis/Binding Solution. Do miksera do homogenizacji przymocować tłuczek dopasowany do probówek o pojemności 0,5 ml, wolny od nukleaz, i zhomogenizować tkankę. Za pomocą niskoretencyjnego końcówki do pipety wolnej od nukleaz przenieść zhomogenizowaną próbkę do dołka okrągłodنnej płytki hodowlanej 96-dołkowej. Bezzwłocznie dodać do próbki 60 μL 100% izopropanolu, używając niskoretencyjnej końcówki do pipety wolnej od nukleaz, i wymieszać, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.
- Do próbki dodać 20 μL Bead Mix za pomocą niskoretencyjnej końcówki do pipety wolnej od nukleaz. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.
- Powtórzyć kroki 5.3-5.4 dla wszystkich próbek tkanek.
- Postępować zgodnie z krokami protokołu MagMAX-96 Total RNA Isolation Protocol, zaczynając od punktu III.A.2, aby zakończyć ekstrakcję całkowitego RNA. UWAGA: W sprzedaży dostępne są inne zestawy do izolacji całkowitego RNA oparte na kuleczkach magnetycznych, jednak nie zostały one przebadane w niniejszym badaniu. W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat izolacji całkowitego RNA przy użyciu odpowiednich produktów należy zapoznać się z instrukcjami producenta danego zestawu.
- Zmierzyć czystość i stężenie otrzymanego całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop 3300 lub innych technologii spektrofotometrycznych/fluorometrycznych do małych objętości.
6. Reprezentatywne wyniki:
| Region mózgu/jądro | Średnica wycinaka do tkanek (mm) | Całkowity RNA (ng/μL) | Stosunek 260/280 |
| Kora czołowa | 2.0 | 27.03 | 1.99 |
| jądro półkoliste | 1.0 | 6.26 | 2.77 |
| Prążkowie | 1.5 | 27.94 | 2.19 |
| Kora obręczy | 1.5 | 29.05 | 2.07 |
| Podwzgórzem - jądro przykomorowe / jądro nadskrzyżowaniowe (PVN/SCN) | 2.0 | 40.34 | 2.03 |
| Wzgórze | 2.0 | 34.40 | 2.00 |
| Podwzgórze – jądro grzbietowo-przyśrodkowe / jądro brzuszno-przyśrodkowe (DMH/VMH) | 2.0 | 44.83 | 2.05 |
| Ciało migdałowate | 1.0 | 10.06 | 1.89 |
| Hipokamp - Ca 2/3 | 1.5 | 7.31 | 2.32 |
| Hipokamp – obszar CA1/zakręt zębaty | 1.5 | 5.20 | 2.24 |
| Szara substancja okołowodociągowa | 1.0 | 48.21 | 2.02 |
| jądro raphe grzbietowe | 1.0 | 6.56 | 2.18 |
| Formacja siateczkowata | 2.0 | 35.35 | 2.27 |
Tabela 1. Wykaz mikrodyssekowanych obszarów mózgu myszy wraz z odpowiednimi optymalnymi średnicami wycinaków do tkanek, reprezentatywną wydajnością i czystością całkowitego RNA. 13 mikrodyssekowanych obszarów mózgu, wymienionych w kolejności od przedniej do tylnej, różni się wielkością i orientacją. Mikrowykrawacz PVN/SCN obejmuje przednio-przyśrodkowe jądro przykomorowe, części jądra okołokomorowego, strefę podprzykomorową oraz inne neurony parvocellularne. Mikrowykrawacz wzgórza obejmuje przednie jądra wzgórza znajdujące się w tej samej płaszczyźnie wieńcowej co obszar mikrowykrawacza PVN/SCN. Mikrowykrawacz DMH/VMH obejmuje dodatkowe jądra magnocellularne oraz inne neurony parvocellularne znajdujące się pomiędzy jądrem grzbietowo-przyśrodkowym a jądrem brzuszno-przyśrodkowym. Próbka ciała migdałowatego obejmuje zarówno podregion centralny, jak i boczno-podstawny. Wydajność RNA oraz stosunki 260/280 są pojedynczymi wartościami uzyskanymi z odpowiednich próbek mikrodyssekcji, aby zaprezentować odczyty otrzymane z każdego obszaru mózgu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym protokole istnieje wiele krytycznych etapów, które wymagają szczególnej uwagi i rozważenia. W celu usunięcia każdego z obszarów zainteresowania należy dobrać odpowiednią średnicę biopsyjnika do tkanek. Choć średnice biopsyjników przedstawione w Tabeli 1 są odpowiednie do pobierania wymienionych obszarów mózgu, każdy badacz powinien dobrać biopsyjnik o rozmiarze zapewniającym optymalne pobranie odpowiednich tkanek. Po drugie, grubość przekrojów czołowych podana w tej metodzie (750 μm) została określona doświa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana przez Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) oraz Army Research Office (ARO), numer grantu W911NF-10-1-006.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| łaźnia wodna Isotemp 102 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Rotator laboratoryjny (mieszalnik orbitalny) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Mieszalnik do pelletowania | VWR international | 47747-370 | |
| pestle 0,5 ml wolny od RNaz | VWR international | KT749521-0590 | wolny od nukleaz |
| piroseczniarz etylowy (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Żyletki dwukrawędziowe | Stoelting Co. | 51427 | |
| St–stykowa slicer do tkanek z manualnym mikrometrem | Stoelting Co. | 51425 | |
| Pędzel okrągły 2/0’szczoteczka | Pędzel Princeton Art | 4350R | |
| biopsyjnik tkankowy Harris Uni-Core (0,75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| igła do biopsji rdzeniowej Harris Uni-Core (1,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| biopsja igłowa Harris Uni-Core (1,5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| biopsja igłowa Harris Uni-Core (2,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Gilotyna | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| DecapiCones | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’zrównoważony roztwór soli (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| pipety 25 ml | Corning | 4489 | wolny od nukleaz |
| końcówki do pipet epT.I.P.S. LoRetention Dualfilter, 20 µl — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| Probówki TrakMates z zakrętkami i nakrętkami | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| bezprzewodowy czytnik kodów 2D VisionMate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| czytnik kodów 2D VisionMate SR do pojedynczego regału | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μuniwersalne końcówki do pipet L | Corning | 4864 | wolne od nukleaz |
| naczynia do hodowli komórkowych Cellstar | Greiner Bio-One | 628160 | wolny od nukleaz |
| 96-dołkowa polistyrenowa płytka do hodowli komórkowych Cellstar firmy Greiner Bio-One, dno w kształcie litery U | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | wolny od nukleaz |
| #4 Papier filtracyjny | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Silikonowy gruszkowy zapobiegacz zasysania do pipet | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| Spektrofotometr NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Bibliografia
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
