$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Konfiguracja i przygotowanie do pobierania próbek
- Uzupełnij zbilansowany roztwór soli Earle'a (EBSS) wodorowęglanem sodu (0,44 g na 100 ml EBSS) i glukozą (0,884 g na 100 ml EBSS)9. Traktować EBSS DEPC (0,1 ml na 100 ml EBSS) przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C w autoklawowalnej butelce lub kolbie z zakrętką.
- Umieść 5 szklanych pipet Pasteura 3/4" w szklanej zlewce o pojemności 1000 ml i umieść pędzle artystyczne, z włosiem skierowanym do góry, w szklanym cylindrze z podziałką o pojemności 100 ml. Dodać wystarczającą ilość roztworu DEPC (0,1 ml na 100 ml ddH2O), aby pokryć odpowiednio pipety i szczoteczki. Przykryć zlewkę i cylinder miarowy folią aluminiową i inkubować przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C.
- Po 12-godzinnej inkubacji za pomocą DEPC podgrzej wszystkie materiały poddane działaniu DEPC do temperatury >100 °C przez co najmniej 15 minut. Wyjąć EBSS i schłodzić do temperatury pokojowej przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C. Wylać ddH2O z dala od zlewki i cylindra miarowego; kontynuować inkubację w temperaturze >100 °C, aż materiały wyschną. Wyjąć, ostudzić do temperatury pokojowej i przechowywać do późniejszego użycia.
- W dniu eksperymentu potraktuj wszystkie powierzchnie robocze RNaseZap.
- Umieścić i utrzymywać EBSS w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C. Aby zbuforować i natlenić EBSS, infiltruj 95%/5% O2 / CO2 , umieszczając rurkę gazową w pipecie Pasteura bez RNaz i wkładając pipetę do EBSS. Zakryj otwór pojemnika EBSS.
- Skonfiguruj krajalnicę do tkanek Stoelting do użytku w seryjnym cięciu tkanki mózgowej. Potraktuj górną i dolną powierzchnię krajalnicy tkanek za pomocą RNaseZap. Przymocuj prostokątny kawałek bibuły filtracyjnej Whatman #4 do powierzchni z pleksi szkła rozdrabniacza do tkanek. Przymocuj żyletkę z podwójnym ostrzem do ramienia rozdrabniacza. Ustaw mikrometr na zero i wyreguluj minimalną wysokość ramienia siekacza, aby żyletka mogła przeciąć bibułę filtracyjną, ale nie płytkę z pleksi.
- Zbierz wszystkie dodatkowe materiały potrzebne do mikrodysekcji, w tym wolne od RNaz szalki do hodowli komórkowych 60x15 mm, rdzenie tkankowe Harris Uni-Core, 200 μl bezRNaz końcówki mikropipet do mocowania na rurkach gazowych w celu natleniania EBSS koronalnych odcinków mózgu podczas wykrawania mikropróbek, zakrzywione nożyczki, suchy lód i probówki do pobierania tkanek. Umieść probówki na suchym lodzie.
2. Usunięcie mózgu i przekrój korony
- Umieść mysz w DecapiCone i odetnij głowę za pomocą gilotyny dla gryzoni. Zdejmij głowę z DecapiCone i umieść ją na płaskiej powierzchni. Za pomocą skalpela przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej czaszki, zaczynając około 3 mm ogonowo do nozdrza. Odsuń z boku płaty skóry z powrotem, aby odsłonić czaszkę i oczodoły.
- Za pomocą zakrzywionych nożyczek przetnij oba nerwy wzrokowe, zrywając ich połączenie z okiem. Otwórz jamę czaszki, ostrożnie łamiąc kości potyliczne i międzyciemieniowe oraz usuwając grzbietowe kości ciemieniowe i czołowe. Za pomocą kości rongeur połam kości nosowe i łzowe, aby odsłonić opuszki węchowe. Użyj zakrzywionych nożyczek, aby odciąć opuszki węchowe od mózgu rostralnego. Usuń cały mózg z nienaruszonym tyłomózgowiem. Umieść mózg w górnej części naczynia do hodowli komórek Cellstar o wymiarach 60 x 15 mm, wolnego od RNaz. Przenieść na powierzchnię roboczą pobierania próbek tkanek.
- Użyj pipety wolnej od RNaz, aby ostrożnie zwilżyć bibułę filtracyjną do dołączonego rozdrabniacza do tkanek za pomocą EBSS. Zwilż tkankę mózgową za pomocą EBSS.
- Przenieś mózg do rozdrabniacza tkanek i ustaw odpowiednią orientację. Uwaga: Mózg powinien być umieszczony tak, aby powierzchnia brzuszna spoczywała na bibule filtracyjnej. Linia środkowa (szczelina międzypółkulowa) powinna być prostopadła do ostrza siekacza, a krawędź rostralna mózgu powinna przylegać do ostrza.
- Użyj pędzla artystycznego nasączonego DEPC, aby utrzymać mózg nieruchomo, wywierając delikatny nacisk na grzbietową powierzchnię mózgu. Trzymając mózg nieruchomo, podnieś dźwignię uchwytu ostrza do góry około 4-5 cm ponad powierzchnię tkanki grzbietowej i przytrzymaj ją w tej pozycji. Zdejmij szczoteczkę z powierzchni mózgu i wybierz 750 μm za pomocą mikrometru. Pozwól, aby dźwignia opadła, siekając tkankę i tworząc przekrój koronalny o długości 750 μm.
- Podczas gdy ostrze siekacza pozostaje nieruchome, użyj ruchu tocznego pędzlem artysty, aby delikatnie odsunąć część tkanki od powierzchni ostrza. Natychmiast umieść wycinek tkanki w natlenionym EBSS na szalce Petriego. Drugi badacz może rozpocząć od kroku 3.1.
- Powtarzaj kroki 2.5 i 2.6, aż uzyskasz seryjne skrawki mózgu na całej płaszczyźnie rostro-ogonowej.
3. Mikrodysekcja obszaru mózgu
- Dostosuj oświetlenie, aby upewnić się, że oświetlenie próbki nie będzie utrudnione podczas mikrodysekcji tkanek. Dostosuj położenie i przepływ 95%/5% mieszankiO2/CO2, aby utrzymać buforowane, natlenione środowisko dla tkanki podczas mikrodysekcji.
- Zidentyfikuj koronalną sekcję mózgu, która obejmuje obszar zainteresowania. Ustaw część mózgu płasko na dnie szalki Petriego za pomocą pędzla artystycznego. Wybierz rdzeń tkankowy o odpowiedniej średnicy na podstawie tabeli 1 lub innych odniesień. Przytrzymując wycinek tkanki koronalnej na miejscu za pomocą pędzla artysty, przesuń końcówkę tnącą rdzenia tkankowego w dół po powierzchni odcinka tkanki.
- Wywierając nacisk, wciśnij końcówkę rdzenia tkankowego przez część tkanki i mocno w dół na dno szalki Petriego. Użyj toczących się ruchów okrężnych, aby upewnić się, że obszar zainteresowania został oddzielony od otaczającej tkanki. Ostrożnie podnieś rdzeń tkankowy z sekcji tkanki i uwolnij mikrodziurk, pozwalając mu unosić się w EBSS.
- Za pomocą pędzla artystycznego natychmiast umieść mikrodziurkowanie tkanek w probówce do przechowywania o stabilnej temperaturze -80 °C, przechowywanej na suchym lodzie. Tkanka powinna łatwo przylegać do boku rurki. Włożyć probówkę zawierającą mikropróbkę z powrotem do suchego lodu.
- Powtórz kroki 3.2 - 3.4 dla każdego obszaru mózgu, który Cię interesuje.
4. Archiwalne tkanki
- Po zakończeniu mikrodysekcji użyj systemu skanera VisionMate, aby zarejestrować odpowiednie kody kreskowe dla każdej probówki TrakMates zawierającej próbkę. Po napełnieniu 96-szczelinowego stojaka na probówki TrakMates szybko zeskanuj stojak i natychmiast umieść próbki tkanek w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
5. Całkowita ekstrakcja RNA
- Przygotuj obszar roboczy wolny od RNaz za pomocą RNaseZap. Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki kulek magnetycznych i roztworu do lizy/wiązania zgodnie z opisem w Protokole Izolacji Całkowitego RNA MagMAX-9610.
- Wyjąć próbki tkanek z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić probówki bezpośrednio na suchym lodzie.
- Dodać 100 μl roztworu do lizy/wiązania do probówki TrakMates zawierającej próbkę. Podłącz niezawierający nukleaz tłuczek o pojemności 0,5 ml wielkości tubki do mieszalnika do peletów i homogenizuj tkankę. Używając końcówki pipety o niskiej retencji, wolnej od nukleaz, przenieś homogenizowaną próbkę do dołka na okrągłodennej 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Natychmiast dodać 60 μl 100% izopropanolu do próbki za pomocą końcówki pipety o niskiej retencji wolnej od nukleaz i mieszać, pipetując w górę i w dół 3-4 razy.
- Dodać 20 μl mieszanki perełkowej do próbki za pomocą końcówki pipety o niskiej retencji, wolnej od nukleaz. Mieszać, pipetując w górę iw dół 3-4 razy.
- Powtórzyć kroki 5.3-5.4 dla wszystkich próbek tkanek.
- Postępuj zgodnie z krokami protokołu izolacji całkowitego RNA MagMAX-96, zaczynając od III.A.2, aby zakończyć ekstrakcję całkowitego RNA. nuta: Inne zestawy do izolacji całkowitego RNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych są dostępne na rynku; Nie zostały one jednak zbadane w tym badaniu. Proszę zapoznać się z instrukcjami producenta zestawów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat całkowitej izolacji RNA przy użyciu odpowiednich produktów.
- Zmierz czystość i stężenie otrzymanego całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop 3300 lub innych technologii spektrofotometru/fluorometru o małej objętości.
6. Reprezentatywne wyniki:
Obszar/jądro mózgu
Średnica rdzenia tkankowego (mm)
Całkowite RNA (ng/μL)
Stosunek 260/280
Kora czołowa
2.0
Godzina 27.03
1,99 pkt.
Jądro półleżące
1,0
Lokal 6,26
Z drugiej strony, 77 TGL
Prążkowiu
1,5
Godzina 27,94
Informacja o tym, że 2,19 roku
Kora obręczy
1,5
Godzina 29.05
Informacja o tym, że 2,07 TGL
Podwzgórze - jądro przykomorowe / jądro nadskrzyżowaniowe (PVN/SCN)
2.0
Z dnia 40,34 zł
Wynik 2.03
Wzgórza
2.0
Godzina 34,40
Godzina 2.00
Podwzgórze - jądro grzbietowo-przyśrodkowe / jądro brzuszno-przyśrodkowe (DMH/VMH)
2.0
44,83 pkt.
Godzina 2,05
Ciało migdałowate
1,0
Godzina 10.06
Kwota 1,89
Hipokamp - Ca 2/3
1,5
Godzina 7,31
Godzina 2,32
Hipokamp - Ca1/Zakręt zębaty
1,5
Godzina 5,20
Pytanie 2,24
Okołowodociągowy szary
1,0
Lokal z numerem 48,21
Pytanie 2,02
Jądro szwu grzbietowego
1,0
Godzina 6,56
Rozdział 2.18
Formacja siatkowata
2.0
Godzina 35,35
Wynik 2,27
Tabela 1. Wyliczenie mikrowypreparowanych obszarów mózgu myszy z odpowiednimi optymalnymi średnicami rdzenia tkankowego, reprezentatywną całkowitą wydajnością RNA i czystością. 13 mikrowypreparowanych obszarów mózgu, wymienionych w kolejności rostro-ogonowej, różni się wielkością i orientacją. Mikropunch PVN/SCN obejmuje przednio-przyśrodkowe jądro przykomorowe, części jądra okołokomorowego, strefę podkomorową i inne neurony parwokomórkowe. Mikropunch wzgórza zawiera jądra przednie wzgórza znajdujące się w tej samej płaszczyźnie koronalnej, co obszar mikropunch PVN/SCN. Mikropunch DMH / VMH obejmuje dodatkowe jądra wielkokomórkowe i inne neurony parwokomórkowe znajdujące się między jądrem grzbietowo-przyśrodkowym a jądrem brzuszno-przyśrodkowym. Próbka ciała migdałowatego obejmuje zarówno podregion centralny, jak i podstawno-boczny. Wydajność RNA i proporcje 260/280 są pojedynczymi wartościami uzyskanymi z odpowiednich próbek mikrodysekcji w celu pokazania odczytów uzyskanych z każdego obszaru mózgu.