Obrazowanie sygnalizacji wapniowej indukowanej nikotyną wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa w kokulturach synaptycznych

Streszczenie

Źródło: Zhong, C., et al., Obrazowanie na żywo sygnalizacji wapniowej indukowanej nikotyną i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film pokazuje, jak aktywacja nikotynowych receptorów acetylocholiny w brzusznym hipokampie myszy za pośrednictwem nikotyny powoduje trwałą sygnalizację wapniową wzdłuż aksonów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Obrazowanie wapnia

1. Szybko przepłukać kultury (5 - 7 dni in vitro) normalnym HBS, a następnie załadować kultury 5 μM wskaźnikiem Fluo-4 Ca²⁺ (ester AM) i 0,02% Pluronic F-127 w HBS (2 ml) przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Wypłukać roztwór Fluo-4 HBS (3 razy/5 min). Umieścić kultury z powrotem w inkubatorze (37 °C / 5% CO_{2 )} przez co najmniej 30 minut.
3. Utrzymuj hodowle (5 - 7 dni in vitro) w komorze obrazowania i zamontuj komorę na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem. Ciągły perfuzja (1 ml/min) z koktajlem HBS w temperaturze pokojowej.
4. Zbieraj obrazy fluorescencyjne Fluo-4 projekcji aksonalnych z mikrowarstw vHipp za pomocą obiektywu planapochromatycznego (60X woda z 1,4 NA, wzbudzenie 488 nm, emisja 530 nm) i kamery CCD.
5. Zbierz wyjściowe obrazy fluorescencji Fluo-4 (co 10 sekund przez 2 minuty) jako kontrolę przed nikotyną. Aplikować nikotynę (1 μM) przez szybką perfuzję (2 ml/min) przez 1 minutę, a następnie zmyć nikotynę koktajlem HBS. Kontynuuj robienie zdjęć poklatkowych przed, w trakcie i po aplikacji nikotyny co 10 sekund przez 30 minut.
6. Zapisz wszystkie klatki surowych obrazów fluorescencji fluo-4 i wyeksportuj je jako serię obrazów TIFF do dalszej analizy.
7. Zbierz zintegrowaną intensywność fluorescencji fluo-4 wzdłuż aksonów vHipp przed i po aplikacji nikotyny.
8. Znormalizuj zintegrowaną intensywność fluorescencji za pomocą następującego równania: ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, gdzie F₀ to skorygowana w tle zintegrowana intensywność fluorescencji sprzed nikotyny, a F to zintegrowana intensywność fluorescencji wzdłuż aksonów vHipp w każdym punkcie czasowym po zastosowaniu nikotyny. Analizuj i wykreślaj znormalizowaną zintegrowaną intensywność fluorescencji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koktajl HBS do obrazowania na żywo pH=7,3
Zawartość NaCl	Sigma	Numer katalogowy S9888	135 mM
Kcl	Sigma	Zobacz materiał P9333	5 mM
Chlorek magnezu	Sigma	Zobacz materiał M8266	1 mM
Chlorek wapnia	Sigma	Zobacz materiał C1016	2 mM
HEPESY	Sigma	H3375	10 mM
glukoza	Sigma	G0350500	10 mM
Tetrodotoksyna	Tocris powiedział:	Numer katalogowy 1078	2 μM
Bicuculline (Bicuculline)	Tocris powiedział:	131 Rozdział 131	10 μM
D-AP-5	Tocris powiedział:	105	50 μM
Sieć CNQX	Tocris powiedział:	1045	20 μM
LY341495	Tocris powiedział:	1209	10 μM

powiedział: powiedział: powiedział: Rozdział szt. SZT.