Badanie przedłużonego depolaryzacyjnego potencjału wtórnego (PDA) w fotoreceptorach Drosophila

Streszczenie

Źródło: Gutorov, R., et al. Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film demonstruje eksperymentalny protokół badania przedłużonego depolaryzującego potencjału (PDA) u białookich Drosophila. Oko muchy jest wystawione na intensywne impulsy niebieskiego światła w celu przekształcenia fotopigmentu rodopsyny w metarodopsynę, inicjując kaskadę sygnalizacyjną, która otwiera kanały jonów dodatnich i powoduje depolaryzację błony. Ponieważ niebieskie światło zapobiega rekonwersji metarodopsyny do rodopsyny, ciągły napływ jonów dodatnich powoduje trwałą depolaryzację, znaną jako przedłużony depolaryzacyjny potencjał wtórny (PDA).

Protokół

1. Pomiar przedłużonego depolaryzacyjnego potencjału wtórnego (PDA) za pomocą elektroretinogramu

1. Odpowiednie warunki chowu dla preparatu Drosophila melanogaster
   1. Muchy Raise D. melanogaster w butelkach zawierających standardową żółtą kukurydzę zawierającą pokarm w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 24 °C i w 12-godzinnym cyklu ciemnym/jasnym.
   2. Butelki z muchami należy przechowywać w ciemności co najmniej 24 godziny przed eksperymentem.
2. Konfiguracja ogólna
   1. Przygotuj pipety rejestrujące, pociągając za kapilary ze szkła borokrzemianowego o wymiarach 1 mm x 0,58 mm (OD x ID) wypełnione włóknami (Rysunek 1L, O). Rezystancja pipet powinna wynosić 5-10 MΩ; Można użyć dowolnego odpowiedniego ściągacza.
   2. Pokryj dwa srebrne przewody AgCl₂, wkładając srebrny drut 0,25 mm do roztworu 3 M KCl podłączonego do niestandardowego zasilacza 5 V.
   3. Włóż każdy powlekany srebrny drut do uchwytów elektrod (Rysunek 1N).
   4. Napełnij szklaną kapilarnę przefiltrowanym roztworem Ringera (patrz Tabela 1) za pomocą strzykawki z wydłużoną końcówką (Rysunek 1M).
   5. Włóż drut elektrodowy do szklanej kapilary. Upewnij się, że roztwór w kapilarze styka się ze srebrnym drutem.
   6. Włóż uchwyty elektrod (Rysunek 2P, N) do dwóch mikromanipulatorów elektrod (Rysunek 2G).
3. Procedura przygotowania muchy do nagrań elektrycznych
   UWAGA: Aby utrzymać muchę w warunkach przystosowanych do ciemności, podczas wykonywania poniższych czynności używaj tylko słabego oświetlenia światłem czerwonym.
   1. Znieczulić muchy w butelce gazem CO₂ za pomocą systemu do podkładów (Rysunek 1A, B) i wlać je do pojemnika do podkładu.
   2. Wybierz jedną muchę i ostrożnie trzymaj ją za skrzydło za pomocą ostrej pęsety. Przykryj resztę much szalką Petriego.
   3. Umieść muchę na uchwycie muchowym we właściwej orientacji - leżąc na boku, tyłem do dłoni (Rysunek 1P).
   4. Włącz zasilanie lutownicy. Ustaw prąd na ~2,25 A. Prąd ten powinien podgrzać żarnik platynowo-irydowy o średnicy 0,25 mm do ~55-56 °C.
   5. Umieść kroplę wosku o niskiej temperaturze topnienia (~55-56 °C) na lutownicy (rysunek 1F).
   6. Za pomocą pęsety podnieś muchę ze skrzydeł i przymocuj jej skrzydła do uchwytu na muchy (Rysunek 1I) za pomocą lutownicy.
   7. Za pomocą lutownicy połącz tył muchy z powierzchnią stojaka za pomocą wosku (Rysunek 1P).
   8. Opuść końcówkę lutownicy na punkt łączenia nóg i rozpuść wosk, aby pokryć wszystkie nogi razem (Rysunek 1P).
   9. Umieść niewielką kroplę wosku między głową a plecami w okolicy szyi (ryc. 1P).
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć przegrzania głowicy muchy. Upewnij się, że mucha jest prawidłowo zamocowana i nie jest w stanie się poruszać podczas eksperymentu; Drobne ruchy mogą powodować powstawanie artefaktów w nagraniach. Upewnij się, że otwory tchawicy (wloty oddechowe) w klatce piersiowej i jamie brzusznej nie są pokryte woskiem.
   10. Umieść uchwyt na muchy (Rysunek 2Q) w ciemnej klatce Faradaya na bloku magnetycznym (Rysunek 2I) i upewnij się, że mucha znajduje się ~5 mm od końca światłowodu (Rysunek 2L).
   11. Umieść elektrodę rejestrującą (rysunek 2P) nad okiem muchy, a elektrodę uziemiającą (rysunek 2N) nad górną częścią pleców muchy za pomocą mikromanipulatorów.
   12. Włóż elektrodę uziemiającą do tylnej części muchy za pomocą mikromanipulatorów.
   13. Włożyć elektrodę rejestrującą w zewnętrzny obwód oka muchy, najlepiej za pomocą mikromanipulatorów.
       nuta: Po włożeniu elektrody do oka zaobserwuje się mały wgłębienie; Pociągnij elektrodę do góry, nie wyjmując jej z oka, aż wgłębienie zniknie. Elektrody można również zanurzać w małych kropelkach galaretki elektrodowej nakładanej na tułów i oko.
4. Protokół PDA (ten protokół może być wykonywany tylko na muchach białookich)
   1. Daj 5-sekundowy impuls świetlny o maksymalnym natężeniu za pomocą pomarańczowego filtra (filtr krawędziowy 590, aby przekształcić maksymalny fotopigment w stan R).
   2. Wymień pomarańczowy filtr na szerokopasmowy niebieski filtr (BP450/40 nm) i daj trzy 5-sekundowe impulsy świetlne o maksymalnej intensywności.
      UWAGA: Możliwe jest również podanie długiego, ciągłego impulsu światła niebieskiego o maksymalnej intensywności, aż do osiągnięcia napięcia w stanie ustalonym.
   3. Odczekaj 60 s w ciemności, wymień niebieski filtr na poprzedni pomarańczowy filtr i daj dwa 5-sekundowe impulsy świetlne w odstępach 60 s.

Tabela 1: Skład roztworu Ringera

szt.

Rozwiązanie Ringera
Odczynnik	Stężenie (mM)
Zawartość NaCl	130
Kcl	cyfra arabska
MgCl2	5
CaCl2	cyfra arabska
HEPESY	10
Miareczkowanie pH do 7,15 przy użyciu NaOH i HCl

Wyniki

Rysunek 1: Narzędzia i urządzenia niezbędne do utrwalania muchy i rejestrowania przygotowania pipet. A) system podkładów w locie; (B) Pedał systemu podkładu w locie; (C) Źródło zimnego światła; D) mikroskop stereoskopowy; (E) grzałka do włókna woskowego; (F) Lutownica; (G) Pedał grzałki żarnika z żarnikiem woskowym; (H) Pęseta szorstka; (I) Magnetyczny stojak na muchy; (J) Wosk o niskiej temperaturz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 1 ml z wydłużoną końcówką			Rysunek 1M
1 szorstka pęseta		Dumont #5, Standardowy	0,1 mm x 0,06 mm, długość 110 mm, Inox (Rysunek 1H)
2 soczewki kondensatora
Przetwornik A/C	Urządzenie molekularne	Digidata 1200	Możliwa zamiana: dowolne dane cyfrowe z urządzeń molekularnych (np. 1440A) - Rysunek 2C
wzmacniacz	Elektronika niemal idealna		Możliwa zamiana: instrumenty Warner - IE251A lub IE-210 (w zestawie ze sceną główną) - Rysunek 2D
Stół antywibracyjny	Newport	VW-3036-OPT-01	Rysunek 7H
Naczyń włosowatych	Aparatura Harvarda	Kapilary ze szkła borokrzemianowego	1 mm x 0,58 mm (rysunek 1O)
Zacisk	Urządzenie molekularne		oprogramowanie
Zbiornik CO2
Zimne źródło światła	Schott	Wyświetlacz LCD KL1500	Rysunek 1C
Delikatne wycieraczki	Kimtech		Chusteczki Kimwipes (Rysunek 1K)
Uchwyt elektrody			Nadaje się do średnicy zewnętrznej kapilarnej 1 mm (rysunek 1N, rysunek 2N i rysunek 2P)
Klatka Faradaya	Domowej roboty		Osłona przed zakłóceniami elektromagnetycznymi i kurtyna przednia (rysunek 2K)
Filtr (kolor)	Schott	OG590, Filtr krawędziowy	Rysunek 2S
Filtr (kolor)	Schott	BP450/40 nm	Rysunek 2S
Filtr (kolor)	Blazers	550 nm	Rysunek 2S
Filtr (kolor) dla zimnego źródła światła	Schott	Zobacz materiał RG630	Rysunek 1C
Filtr (ciepło)	Schott	KG3	Rysunek 1S
Filtry (filtr o neutralnej gęstości)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0,5,0,3	Rysunek 2S
System lamp błyskowych	Honeywell		Rysunek 2U
System podkładów muchowych z wtryskiwaczem	Wtrysk + matic		Rysunek 1A-B
Zasilanie lampy	Pti	Płyta LPS-220	Rysunek 2W
Detektor światła	Domowej roboty		Fototranzystor (rysunek 2O)
Światłowód			Średnica 3 mm, długość 1,3 m (Rysunek 2L,M)
Źródło światła			Wysokoprężna, bezozonowa lampa ksenonowa o mocy 75 W (pracująca z mocą 50 W), możliwa wymiana: Cairn research - OptoLED (rysunek 7R)
Wosk topliwy w niskiej temperaturze	Domowej roboty		Składa się z mieszaniny wosku pszczelego (Tm≈62 °C) i parafiny w temperaturze ~3:1 w celu osiągnięcia temperatury topnienia ~55–56 °C (rysunek 6J)
Stojak magnetyczny na muchy	Domowej roboty		Rysunek 1I i Rysunek 2Q
System przedwzmacniacza mikroelektrodowego ze stopniem czołowym	Elektronika niemal idealna		Tester impedancji (rysunek 2G)
Mikromanipulator (mechaniczny zgrubny)	Tritech Research, Narishige	M-2
Mikromanipulator (mechaniczny precyzyjny)	Mikrosystemy Leitz	Mikromanipulator mechaniczny Leitz	Rysunek 2F
Zacisk pCLAMP	Urządzenie molekularne		oprogramowanie
szalka Petriego			60 mm
Generator impulsów	WZMACNIACZ	Mistrz 8	Rysunek 2A
Redux krem do elektrokardiografii	Laboratoria Parker	Redux Electrolyte Crème
Sterownik migawki	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Jednokanałowy Uni-stabilny	Rysunek 2V
System żaluzji	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Żaluzje jednostabilne	Rysunek 2V
Srebrny drut	Instrumenty Warnera		Średnica 0,25–1 mm, wymaga chlorowania
Lutownica składająca się z włókna platynowo-irydowego			Średnica 0,25 mm (Rysunek 2F)
Mikroskop z zoomem stereoskopowym	Nikon	SMZ-2B	Rysunek 1D
Mikroskop z zoomem stereoskopowym	dziki	Dziki M5	Z 6, 12, 25 i 50 ustawieniami powiększenia (rysunek 2E)
Filtry strzykawkowe	Młyny Millex		Filtr PVDF 22 μm
Pionowy ściągacz do pipet	Sutter/ Narishige	modelu P-97/PP-830	Użyj ściągacza pionowego lub poziomego, w zależności od preferencji (Rysunek 1L)
Podgrzewacz filamentu woskowego	Domowej roboty		Rysunek 1E-G
System ksenonowych lamp błyskowych	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2 (wersja angielska)	Rysunek 2X

powiedział: