Wizualizacja i mapowanie ścieżek neuronalnych w wycinku mózgu ciała migdałowatego

Abstract

Źródło: Bosch, D., et al. Ex vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje procedurę analizy połączeń synaptycznych między przyśrodkową korą przedczołową (mPFC) a neuronami ciała migdałowatego za pomocą ostrych wycinków mózgu ciała migdałowatego od myszy. Neurony mPFC u tych myszy wyrażają rodopsynę kanałową połączoną z białkiem fluorescencyjnym. Rodopsyny kanałowe ułatwiają napływ jonów i generowanie potencjału czynnościowego w neuronach mPFC po aktywacji światłem. W konsekwencji neurony mPFC uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z postsynaptycznym neuronem ciała migdałowatego, wyzwalając prądy postsynaptyczne, które są rejestrowane w celu wizualizacji połączenia mPFC-ciało migdałowate.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Wizualizacja i stymulacja włókien presynaptycznych

1. Przygotuj mikroskop płatowy do optogenetycznej aktywacji włókien i komórek:
   1. Wyśrodkuj zamontowaną diodę elektroluminescencyjną (LED) na ścieżce dostarczania światła.
   2. Zmierz natężenie światła LED w tylnej płaszczyźnie ogniskowej i na wyjściu każdego obiektywu za pomocą miernika mocy, wybierając odpowiednią długość fali 470 nm.
   3. Oblicz natężenie światła w mW/^mm2 i utwórz krzywą kalibracyjną (natężenie LED (%) w funkcji strumienia świetlnego (mW/mm²)) dla każdego celu dla wartości mierzonych dla długości fali 470 nm.
2. Pobrać wycinek ciała migdałowatego z komory interfejsu i umieścić w komorze na wycinek zamontowany na mikroskopie pionowym wyposażonym w lampę fluorescencyjną. Należy zwrócić uwagę, aby ustawić plasterek w taki sposób, aby powierzchnia warstwy skierowana do góry w komorze interfejsu była również skierowana do góry w komorze nagrywania. Perfuse slice ze świeżym, natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF) w ilości 1 - 2 ml/min w temperaturze ~31 °C.
3. Obserwuj włókna presynaptyczne w wycinku za pomocą lampy fluorescencyjnej w połączeniu z odpowiednimi zestawami filtrów dla określonego białka fluorescencyjnego eksprymowanego. Użyj obiektywu 5x, aby uzyskać przegląd (rysunek 1E) i obiektywu 60x, aby ocenić gęstość włókien w obszarze docelowym.
   Uwaga: W przypadku GFP i YFP należy użyć zestawu filtrów "zielony" (wzbudzenie 472/20, rozdzielacz wiązki 495, emisja 490 LP) w przypadku mCherry użyj zestawu filtrów "czerwony" (wzbudzenie 560/40, rozdzielacz wiązki 585, emisja 630/70) zgodnie z tabelą materiałów/wyposażenia.
4. Otwórz lub ogranicz aperturę w ścieżce światła mikroskopu zgodnie z potrzebami eksperymentu (rysunek 2D).
5. Aby uzyskać zapis plastra, należy napełnić pipetę z plastrem roztworem wewnętrznym i zamontować ją w uchwycie elektrody. Zastosować nadciśnienie do pipety z plastrem i powoli zanurzyć ją najpierw w roztworze do kąpieli, a następnie, pod kontrolą wzrokową, do plastra za pomocą mikromanipulatora.
   1. Zbliż się do interesującego neuronu za pomocą pipety z plastrem z boku i od góry. Uwolnij nadciśnienie, gdy pipeta znajdzie się na powierzchni celi (wgłębienie widoczne na powierzchni komórki) i uzyskaj "gigaseal" poprzez zastosowanie podciśnienia.
   2. Zastosuj dalsze ssanie, aby rozerwać łatkę błony, aby uzyskać zapis całej komórki. Następnie stymuluj znakowane włókna za pomocą podłączonej diody LED za pomocą odpowiedniej długości fali do aktywacji rodopsyny kanałowej (ChR) (470 nm), jednocześnie rejestrując odpowiedzi elektryczne z komórki.
   3. W przypadku stymulacji synaptycznej zacznij od niskiej intensywności diody LED i zwiększaj, aż do osiągnięcia pożądanej amplitudy prądu synaptycznego. Uruchom diodę LED, konfigurując wyjścia cyfrowe w oprogramowaniu do akwizycji danych, aby kontrolować czas i długość impulsu (przykłady na rysunku 3).
      Uwaga: inne oprogramowanie i/lub urządzenia generujące TTL mogą być używane do wyzwalania diody LED.
6. Powtórzyć stymulację z otwartym lub ograniczonym otworem (krok 1.4) w ścieżce świetlnej mikroskopu zgodnie z życzeniem dla następnej zarejestrowanej komórki i/lub w obecności określonych leków.

Results

Rysunek 1. Zastrzyki stereotaktyczne, przygotowanie ostrych wycinków mózgu i wizualizacja włókien presynaptycznych. (A, B) Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa. A) Zdjęcie znieczulonej myszy umieszczonej w stereotaktycznej ramie z odsłoniętą czaszką i pipetą do wstrzykiwań. Wstawka: Powiększ obraz pipety iniekcyjnej wypełnionej roztworem wirusa zmieszanym z szybkim zielonym kolorem....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)	Kompozycja znajduje się w odnośnikach #16 i #23
Wewnętrzne rozwiązania w zakresie poprawek	Kompozycja znajduje się w odnośnikach #16 i #23
Siarczan magnezu siedmiowodny	Roth, Niemcy	Zobacz materiał P027.1	przygotować 2M roztwór podstawowy w oczyszczonej wodzie
Stereoskop, SZX2-RFA16	Olympus, Japonia
Świetlówka Xcite (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Kanada	2012-12699
Mikroskop krosowy, BX51WI	Olympus, Japonia
Wzmacniacz krosowy Multiclamp 700B	Urządzenia molekularne, Stany Zjednoczone
Dane cyfrowe 1440A	Urządzenia molekularne, Stany Zjednoczone
Oprogramowanie PClamp, wersja 10	Urządzenia molekularne, Stany Zjednoczone		służy do sterowania akwizycją i stymulacją danych
Regulator temperatury kąpieli, TC05	Luigs & Neumann, Niemcy	200-100 500 0145
Mikromanipulator trzyosiowy Mini 25	Luigs & Neumann, Niemcy	210-100 000 0010
Sterownik mikromanipulatora SM7	Luigs & Neumann, Niemcy	200-100 900 7311
Kapilary szklane do pipet krosowych	World Precision Instruments, Niemcy	Zobacz materiał GB150F-8P
Bibuła filtracyjna z azotanu celulozy do komory interfejsu	Satorius Stedim Biotech, Niemcy	13006--50----ACN
Jednostka LED, CoolLED pE	CoolLED, Wielka Brytania	244-1400	CoolLED lub USL 70/470 i odpowiednie adaptery to dwie alternatywne opcje stymulacji LED
CoolLED 100 Dual Adapt	CoolLED, Wielka Brytania	PE-ADAPTER-50E
Jednostka LED, USL 70/470	Rapp Optoelektroniczny	L70-000
Adapter dwuportowy	Rapp Optoelektroniczny	Zapytaj firmę
Zestaw filtrów: czerwony (wzbudzenie)	AHF, Niemcy	F49-560	Filtry można kupić w zestawie F46-008
(rozdzielacz wiązki)	AHF, Niemcy	F48-585
(emisja)	AHF, Niemcy	F47-630
Zestaw filtrów zielony (wzbudzenie)	AHF, Niemcy	F39-472	Alternatywy: zestaw filtrów F36-149 lub F46-002 (z emisją pasma przepustowego)
(rozdzielacz wiązki)	AHF, Niemcy	F43-495W
(emisja)	AHF, Niemcy	F76-490
LaserCheck, ręczny miernik mocy	Spójny, Stany Zjednoczone	1098293
Oprogramowanie IgorPro, wersja 6	Wavemetrics, Stany Zjednoczone		Do analizy danych elektrofizjologicznych można również wykorzystać inne alternatywne pakiety oprogramowania
Neuromatyczny zestaw makr dla IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com